基因功能分析的基本策略

第十二章基因功能分析的基本策略轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：外源基因?qū)肷矬w表達。基因打靶：外源基因替換內(nèi)源基因。基因敲除?；蚯萌搿；虺聊簩胩囟ɑ?，抑制內(nèi)源性基因表達。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：將外源基因?qū)爰毎?，隨機整合到受體基因組內(nèi)，并隨細胞分裂而遺傳給后代。細胞模型。轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因植物。一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗，金屬硫蛋白基因啟動子驅(qū)動大鼠生長激素基因表達。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。基本原理供體基因受體的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因動物基本過程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達的檢測與細胞篩選1.上游—基因改造和載體構(gòu)建外源基因:完整的轉(zhuǎn)錄單位,由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。報告基因(reportergene):在表達載體中引入易于檢測的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。動物轉(zhuǎn)基因常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非病毒類載體：如質(zhì)粒等。2.中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學和生物學方法

1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細胞法（embryonicstemcells,ES細胞）

3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

4)精子載體法1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉(zhuǎn)移注射卵到輸卵管或子宮。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉(zhuǎn)入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達，影響轉(zhuǎn)基因動物的正常發(fā)育和代謝。總效率較低(實際成功率1/1000)。提高顯微注射DNA表達的成功率轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達，最好是可以誘導表達。轉(zhuǎn)入基因中應該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導表達啟動子外源基因2)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcells,ES細胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細胞，當把這種胚胎細胞重新導入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細胞的能力。ES細胞具有與胚胎細胞相似的形態(tài)特征和分化特性。胚胎干細胞法分離和培養(yǎng)ES細胞。外源基因?qū)隕S細胞。導入外源基因的ES細胞的子宮轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)胚胎干細胞胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細胞外源DNA的導入DNA胚胎干細胞囊胚原囊胚轉(zhuǎn)基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法微注射外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進行轉(zhuǎn)錄的地方。胚胎干細胞法的特點定點整合。ES細胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導入后可用正-負選擇法篩選擇正確整合的ES細胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建獲得四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒感染四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。4）精子載體法外源DNA精子卵細胞受精卵轉(zhuǎn)基因動物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動物微注射顯微注射3.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的mRNA的存在與否以及表達水平。蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達以及功能檢測。鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系三、轉(zhuǎn)基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型?；虍a(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應器。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過程。為測試各種可能的治療方案提供一個統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因動物模型提供了人類疾病的研究手段。人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。利用轉(zhuǎn)基因動物反應器生產(chǎn)藥用蛋白轉(zhuǎn)基因動物反應器：乳腺、膀胱、血液生物反應器等?？鼓窱II：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素轉(zhuǎn)基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴重肝病患者的離體生命支持物。動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細胞提供細胞核，卵細胞提供細胞質(zhì)發(fā)育而來。核移植技術(shù)（NuclearTransfer)核移植技術(shù)（NuclearTransfer)第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):將某個基因定向去除?；蚯萌?geneknockin):定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄?。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構(gòu)建。打靶載體導入ES細胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因2.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法顯微注射法打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。2個不同的胸