第四章 抗生素的分離純化1

第四章抗生素的分離和純化姜勇第一節(jié)抗生素分離的基本過程第二節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理、固-液分離和細(xì)胞破碎第三節(jié)溶劑萃取法提取抗生素第四節(jié)離子交換法提取抗生素第五節(jié)吸附法提取抗生素第六節(jié)沉淀法提取抗生素第七節(jié)抗生素的精制第一節(jié)抗生素分離的基本過程

抗生素生產(chǎn)過程的最后一個(gè)環(huán)節(jié)是把目標(biāo)產(chǎn)物從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中分離提取出來。多數(shù)抗生素產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)微生物發(fā)酵或酶反應(yīng)過程，并通過包括產(chǎn)物回收、粗分離、純化及精制等處理后，才能符合一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在抗生素生產(chǎn)過程中一般將微生物發(fā)酵和酶反應(yīng)過程稱為“上游過程”，而與之相應(yīng)的產(chǎn)物回收、粗分離、純化及精制等后續(xù)過程就稱之為“下游過程”，或稱之為生化分離和純化過程。眾所周知，要使抗生素的生產(chǎn)走向產(chǎn)業(yè)化，必須要上下游過程兼容、協(xié)調(diào)、以使全過程能優(yōu)化進(jìn)行?？股匕l(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)：①產(chǎn)物濃度低的水溶液(原因：a氧傳遞限制；b細(xì)胞量;c產(chǎn)物抑制）②組分復(fù)雜(a大分子;b小分子;c可溶物;d

不可溶物;e化學(xué)添加物）③產(chǎn)物穩(wěn)定性差(a化學(xué)降解(pH,溫度);b微生物降解（酶作用，染菌）④質(zhì)量要求高發(fā)酵成熟液中常含有各種樣的雜質(zhì)，而所需要的發(fā)酵產(chǎn)物則含量很少。因此，要獲得純凈的發(fā)酵產(chǎn)物，它的提取與精制過程便成為一個(gè)復(fù)雜而必不可少的工藝過程。提取和精制的目的在于從發(fā)酵液中制取高純度的、合符質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的發(fā)酵成品。抗生素藥物質(zhì)量要求(1)效價(jià)(2)鑒定(3)毒性試驗(yàn)(4)核酸(5)均一(6)無沖突活性生物分離工藝要求(1)高純度(2)大規(guī)模(3)經(jīng)濟(jì)性(4)安全性

生物下游加工過程的一般步聚一般抗生素產(chǎn)品的提取過程大體可分為六個(gè)階段：①原料的選擇和預(yù)處理；②原料的粉碎；③提取，即從原科中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過程；④純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過程；⑤干燥及保存；⑥成品及制劑的制備，即半成品或原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應(yīng)用的各種劑型?？股叵掠渭庸み^程的選擇準(zhǔn)則①步聚少②次序合理③產(chǎn)品規(guī)格（注射，非注射）④生產(chǎn)規(guī)模⑤物料組成⑥產(chǎn)品形式固體適當(dāng)結(jié)晶，液體，適當(dāng)濃縮⑦產(chǎn)品穩(wěn)定性⑧物性溶解度，分子電荷，分子大小，功能團(tuán)，穩(wěn)定性，揮發(fā)性⑨危害性⑩廢水處理分離抗生素產(chǎn)品時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題

從發(fā)酵液中提取抗生素時(shí)，通常要注意以下幾個(gè)問題：1)發(fā)酵液的組成成分非常復(fù)雜，有數(shù)百種甚至更多，各種化合物的形狀、大小、相對(duì)分子質(zhì)量和理化性質(zhì)都各不相同，有的迄今還是未知物，而且這些化合物在分離時(shí)仍在不斷的代謝變化中。2)在發(fā)酵液中，有些抗生素含量很低或極微，有的只有1/10000，甚至更少。制備時(shí)，原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。3)許多抗生素，一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境，很易變性和被破壞，應(yīng)十分注意保護(hù)這些化合物的生物活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進(jìn)行。一般來說制備的操作時(shí)間長(zhǎng)、手續(xù)較繁瑣。因?yàn)樵S多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機(jī)械作用、強(qiáng)烈的輻射和機(jī)體內(nèi)自身酶的作用，均可破壞這些分子的結(jié)構(gòu)或生理活性。4)抗生素的分離制備過程幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種溫度、pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)，對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實(shí)驗(yàn)或工藝的設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)，常帶有很大的經(jīng)驗(yàn)成分。因此，要建立重復(fù)性好的成熟工藝，對(duì)生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴(yán)格地加以規(guī)定。就目前的發(fā)展和應(yīng)用情況來看，在抗生素產(chǎn)品的開發(fā)研究中，后處理過程等的研究費(fèi)用約占全部費(fèi)用的50%以上，在產(chǎn)品的成本構(gòu)成中，后處理成本占總成本的40%-80%,對(duì)于精細(xì)藥用產(chǎn)品，此比例就更高。生產(chǎn)過程中后處理投入的人力和物力占全部的70%-90%。

抗生素的后處理分離純化技術(shù)和工藝不僅影響產(chǎn)品的質(zhì)量和成本，也決定著產(chǎn)品的產(chǎn)量?？股禺a(chǎn)品由于沒有適當(dāng)?shù)奶崛?、分離和純化方法或因回收率太低致使生產(chǎn)成本過高而不能投產(chǎn)的例子是屢見不鮮的。

發(fā)酵液的一般性質(zhì)

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法和提取、精制方法的選擇也有差異。應(yīng)針對(duì)發(fā)酵液的特性來合理選擇處理方法，大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在發(fā)酵液中，也有少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在菌體中，或發(fā)酵液和菌體都含有，例如四環(huán)類抗生素。各種發(fā)酵產(chǎn)物無論在發(fā)酵液或是在菌中體現(xiàn)往往濃度較低，并與種種的溶解和懸浮的雜質(zhì)混在一起，要分離提純發(fā)酵產(chǎn)物，首先要針對(duì)發(fā)酵液的特性進(jìn)行預(yù)處理。第二節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理、固液分離和細(xì)胞破碎發(fā)酵液的特性一般可歸納為：1、發(fā)酵液大部分是水，一般含量達(dá)90%-99%.2、發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，盡管由于菌種、原料、工藝條件不同，發(fā)酵產(chǎn)物于發(fā)酵液中濃度的高低也有差異，但總的來說發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物濃度都是比較低的，而抗生素的濃度一般在1%以下。3、發(fā)酵液中的懸浮固體物主要含有菌體和蛋白質(zhì)膠狀物。由于發(fā)酵液中存在一定數(shù)量的菌體和蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)，不僅使發(fā)酵液粘度增加，不利于過濾，而且增加提取和精制后工序的操作困難，在濃縮過程中變得更粘稠，同時(shí)容易產(chǎn)生泡沫。4、發(fā)酵液的培養(yǎng)基殘留成分中還含有無機(jī)鹽類，非蛋白質(zhì)大分子其降解產(chǎn)物對(duì)提取和精制均有一定的影響。5、發(fā)酵液中除了發(fā)酵產(chǎn)物外，常有其他少量的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵過程中除了主代謝產(chǎn)物外，尚伴有一些其他的副代謝產(chǎn)物。這些少量的副產(chǎn)物，有時(shí)其結(jié)構(gòu)特性與發(fā)酵主產(chǎn)物極為近似，這就會(huì)給分離提純操作帶來困難。6、發(fā)酵液中還含有色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)。盡管它們的確切組成還不十分明了，但它們對(duì)提煉影響相當(dāng)大。為了保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)通過預(yù)處理將色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)先除去。

菌體細(xì)胞的分離固體懸浮物的去除蛋白質(zhì)的去除重金屬離子的去除色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的去除改善培養(yǎng)液的處理性能調(diào)節(jié)適宜的PH和溫度

培養(yǎng)液預(yù)處理的主要內(nèi)容

加熱由于加熱可能使某些熱敏感性蛋白發(fā)生不可逆的變性，因此這種預(yù)處理方法僅適用于對(duì)非熱敏感性產(chǎn)品發(fā)酵液的預(yù)處理。適當(dāng)加熱之后，發(fā)酵液中的蛋白由于變性而凝聚，形成較大的顆粒，發(fā)酵液的粘度就會(huì)降低，一般加熱的用65-80度。調(diào)節(jié)PH值適當(dāng)?shù)腜H值可以提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減少其在隨后的分離純化過程中的損失。此外，發(fā)酵液PH值的改變會(huì)影響發(fā)酵液中某些成分的電離程度，從而降低發(fā)酵液的粘度。在調(diào)節(jié)PH值時(shí)要注意選擇比較溫和的酸和堿，以防止局部過酸或過堿。草酸是一種較常用的PH值調(diào)節(jié)劑。加入絮凝劑通常情況下，細(xì)菌的表面都帶有負(fù)電荷，可以在發(fā)酵液中加入帶正電荷的絮凝劑，從而使菌體細(xì)胞與絮凝劑結(jié)合形成絮狀沉淀，降低發(fā)酵液的上粘度，利于菌體的收獲。培養(yǎng)液的固液分離方法分離前的處理固-液分離過程的分類序號(hào)方法原理設(shè)備1絮凝利用電荷中和及大分子橋聯(lián)作用形成更大的粒子2離心在離心產(chǎn)生的策略場(chǎng)作用下，加快顆粒的沉降速度高速冷凍離心機(jī)蝶片式離心機(jī)管式離心機(jī)傾析式離心機(jī)筐式離心機(jī)3過濾依據(jù)過濾介質(zhì)的空隙大小進(jìn)行分離板框過濾機(jī)平板過濾器真空旋轉(zhuǎn)過濾機(jī)管式過濾器蜂窩式過濾器深層過濾器4膜分離依據(jù)被分離的分子大小和膜孔大小進(jìn)行分離平板、卷曲、中空纖維、管式微孔過濾器平板、卷曲、中空纖維，管式超濾器平板滲透器半透膜型、離子半透膜型電滲析器固-液分離常用技術(shù)及其特點(diǎn)圖8—2細(xì)胞破碎方法的分類干燥處理機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用流體剪切作用破碎方法溶胞處理珠磨法壓榨法超聲法化學(xué)法物理法高壓勻漿酶溶法

細(xì)胞破碎就是通過采用不同手段破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，轉(zhuǎn)入液相中，以便于進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化。細(xì)胞破碎的方法有很多，按照是否存在在外加作用力可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。如圖8-2為細(xì)胞破碎方法的分類。下表中列出了主要的細(xì)胞破碎方法的原理，使用的設(shè)備、特點(diǎn)和存在的缺點(diǎn)。細(xì)胞的破碎細(xì)胞破碎方法序號(hào)方法原理設(shè)備特點(diǎn)缺點(diǎn)1壓力破碎法利用壓力釋放時(shí)的液固剪切進(jìn)行破碎壓力破碎機(jī)操作簡(jiǎn)便，可連續(xù)操作，適用于不同的細(xì)胞加壓放熱，需要冷卻，否則生物活性物質(zhì)會(huì)失活；破碎率較低，壓力不穩(wěn)定，需要進(jìn)行反復(fù)破碎2珠磨破碎法利用固體的剪切進(jìn)行破碎細(xì)胞珠磨破碎機(jī)操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可連續(xù)批式操作，破碎率可以控制，容易放大，適用于工業(yè)放大珠磨時(shí)會(huì)放熱，需要高效冷卻，不同細(xì)胞的破碎條件差異大3超聲波破碎法利用超聲波形成空穴產(chǎn)生壓力沖擊使進(jìn)行破碎超聲破碎機(jī)操作簡(jiǎn)便，可連續(xù)或批式操作超聲波處理會(huì)產(chǎn)熱，需要冷卻，破碎率較低，需反復(fù)進(jìn)行破碎，應(yīng)用面較窄4滲透壓法利用滲透壓的突變，造成細(xì)胞內(nèi)壓力差而引起細(xì)胞的破碎適用于位于胞內(nèi)質(zhì)的產(chǎn)物釋放，細(xì)胞的破碎率低，但產(chǎn)物的釋放較好，純度較高操作比較復(fù)雜，條件要求嚴(yán)格，只適用于少量櫚的處理，費(fèi)用高5有機(jī)溶劑或表面活性劑法利用有機(jī)溶劑或表面活性劑改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使胞內(nèi)產(chǎn)物得以釋放方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞內(nèi)含物釋放少，產(chǎn)物較純，可大規(guī)模應(yīng)用適用性有限，只適合于對(duì)有機(jī)溶劑或表面活性劑穩(wěn)定的產(chǎn)物6堿或酶處理法經(jīng)堿或酶的處理使細(xì)胞壁或膜破壞，使產(chǎn)物釋放出來方法簡(jiǎn)單，可大規(guī)模應(yīng)用適用性有限，只適合于對(duì)堿或酶穩(wěn)定的產(chǎn)物一、溶劑萃取概述第三節(jié)溶劑萃取法提取抗生素

萃取是分離液體混合物常用的單元操作，在發(fā)酵和其它生物工程生產(chǎn)上的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛，其中，萃取操作不僅可以提取和增濃產(chǎn)物，還可以除掉部分其它類似的物質(zhì)，使產(chǎn)物獲得初步的純化，所以廣泛應(yīng)用在抗生素發(fā)酵產(chǎn)物的提取上。

從發(fā)酵或其它生物反應(yīng)溶液中除去不溶性固體物質(zhì)后，通常就進(jìn)入產(chǎn)物提取階段。生物工程不同于化工生產(chǎn)，主要表現(xiàn)在生物分離往往需要從濃度很稀的水溶液中除去大部分的水，而且反應(yīng)液中存在多種副產(chǎn)物和雜質(zhì)，在分離提取產(chǎn)物的同時(shí)，也往往使物理化學(xué)性質(zhì)類似的雜質(zhì)濃集，因而使產(chǎn)物的提取精制費(fèi)用增加。近20年來研究溶劑萃取技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合從而產(chǎn)生了一系列新的分離技術(shù)，如：①逆膠束萃?。≧eversedMicelleExtraction）②超臨界萃取（SupercriticalfluidExtraction）③液膜萃?。↙iquidMembraneExtraction）④微波輔助萃助

（microwave—assistedextraction，MAE)

溶劑萃取在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用溶劑萃取的典型應(yīng)用主要在二個(gè)方面:①?gòu)陌l(fā)酵培養(yǎng)液中萃取化合物（產(chǎn)物）萃取的目標(biāo)產(chǎn)物是在微生物細(xì)胞發(fā)酵期間或者微生物細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的，但是也不完全如此，被萃取的產(chǎn)物釋放在發(fā)酵培養(yǎng)基中，溶劑萃取過程的主要目的是將化合物從細(xì)胞釋放的其他類似物中有效地分離出來。②從生物液或生物轉(zhuǎn)化液中萃取產(chǎn)物，在這種情況下，是利用不同純化度的細(xì)胞或酶來進(jìn)行生化反應(yīng)，使底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，其溶劑萃取過程與發(fā)酵液中的萃取情況不同，它是從未反應(yīng)的底物中分離反應(yīng)得到的產(chǎn)物。

溶劑萃取法的特點(diǎn)（1） 萃取過程有選擇性（2） 能與其它步聚相配合（3） 通過相轉(zhuǎn)移減少產(chǎn)品水解（4） 適用于不同規(guī)模（5） 傳質(zhì)快（6） 毒性與安全環(huán)境問題溶液萃取過程雜質(zhì)溶質(zhì)原溶劑萃取劑LightphaseHeavyphase溶劑萃取法溶液萃取過程溶劑萃取法的萃取原理是以分配定律為基礎(chǔ)的溶液萃取過程溶劑萃取法是利用液體混合物各組分在某有機(jī)溶劑中的溶解度的差異而實(shí)現(xiàn)分離的。在溶劑萃取中，被提取的溶液稱為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱為溶質(zhì)，用以進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑。經(jīng)接觸分離后，大部分溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中，得到的溶液稱為萃取液，而被萃取出溶質(zhì)的料液稱為萃余液。生物萃取與傳統(tǒng)萃取相比的特殊性①成分與相復(fù)雜