醫(yī)學微生物學――第二十一章真菌概述

醫(yī)學微生物學――第二十一章真菌概述第二十一章真菌概述真菌(fungus)是一種真核細胞型微生物。有典型的細胞核和完善的細胞器。不含葉綠素、無根、莖、葉的分化。真菌廣泛分布于自然界，種類繁多，有10余萬種。大多對人無害，有的甚至有益。如食用蕈類，有的真菌用于生產抗生素和釀酒等。引起人類疾病的約300余種，包括致病、條件致病、產毒以及致癌的真菌。近年來真菌感染明顯上升。這與濫用抗生素引起菌群失調和應用激素、抗癌藥物導致免疫低下有關，應引起注意。與醫(yī)學有關的真菌有四個亞門：①接合亞門(Zygomycotina),絕大多數為無隔多核菌絲體，屬條件致病性真菌，如毛霉、根霉等。②子囊菌亞門(Ascomycotina)，具有子囊和子囊孢子，如芽生菌屬、組織胞漿菌屬、小孢子菌屬及酵母菌屬等。③擔子菌亞門(Basidiomycotina)，具有擔子和擔孢子，如食用菌蘑菇、靈芝以及致病性新生隱球菌等。④半知菌亞門(Deutermycotina或fungusimperfecti)，對此類菌生活史了解不完全，未發(fā)現其有性階段，故稱之為半知菌。在醫(yī)學上有重要意義的真菌絕大部分在半知菌亞門中，如球孢子菌屬和假絲酵母菌屬。最新的真菌分類是將真菌界分為4個門，即接合菌門(Zycomycota)、擔子菌門(Basidomycota)、子囊菌門(Ascomycota)和壺菌門(Chytridiomycota),而將原半知菌亞門中的真菌劃分到前3個門中。第一節(jié)真菌的生物學性狀真菌可分單細胞和多細胞兩類。單細胞真菌呈圓形或卵圓形，稱酵母菌(yeast)。多細胞真菌大多長出菌絲和孢子，交織成團，稱絲狀菌filamentousfungus)，又稱霉菌(mold)。有些真菌可因環(huán)境條件的改變，而兩種形態(tài)發(fā)生互變，稱為二相性(dimorphic),如球孢子菌、組織胞漿菌、芽生菌和孢子絲菌等。這些真菌在體內或在含有動物蛋白的培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)時呈酵母菌型，在普通培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)時則呈絲狀菌。形態(tài)與結構真菌比細菌大幾倍至幾十倍。結構比細菌復雜。細胞壁不含肽聚糖，主要由多糖(75%)與蛋白質(25%)組成。多糖主要為幾丁質的微原纖維，缺乏肽聚糖，故真菌不受青霉素或頭孢菌素的作用。真菌的細胞膜與細菌的區(qū)別在于真菌含固醇於土?^1)而細菌無。單細胞真菌呈圓形或卵圓形，常見于酵母菌或類酵母菌，對人致病的主要有新生隱球菌和白假絲酵母菌。這類真菌以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脫落成獨立個體。多細胞絲狀真菌能長出菌絲，菌絲延伸分枝，有的菌絲上長出孢子。各種絲狀菌長出的菌絲和孢子形態(tài)不同，是鑒別真菌的重要標志。.菌絲(hypha)真菌的孢子以出芽方式繁殖。在環(huán)境適宜情況下由孢子長出芽管，逐漸延長呈絲狀，稱菌絲。菌絲又可長出許多分枝，交織成團稱菌絲體(mycelium)。有的菌絲伸入培養(yǎng)基中吸取養(yǎng)料，稱營養(yǎng)菌絲。有的菌絲向上生長，稱氣生菌絲。其中產生孢子的稱生殖菌絲。有的菌絲內能形成橫隔，稱隔膜(septum)，將1條菌絲分成幾個細胞，是為有隔菌絲(septatehypha)。大多數致病性真菌均有隔膜，隔膜中有小孔，允許胞質流通。皮膚癬菌、組織胞漿菌和曲霉等孔較大，細胞核亦可通過;有些真菌菌絲無橫隔，為無隔菌絲(nonseptatehypha)。整條菌絲為1個細胞，在1個細胞內有多個細胞核。菌絲可有多種形態(tài)：螺旋狀、球拍狀、結節(jié)狀、鹿角狀和梳狀等。不同種類的真菌可有不同形態(tài)的菌絲，故菌絲形態(tài)有助于鑒別。.孢子(spore)是真菌的繁殖結構，真菌的孢子與細菌的芽胞不同，其抵抗力不強，加熱60~70℃短時間即可死亡。孢子可分有性孢子和無性孢子兩種。有性孢子是由同一菌體或不同菌體上的2個細胞融合經減數分裂形成。無性孢子是菌絲上的細胞分化或出芽生成。病原性真菌大多形成無性孢子。無性孢子根據形態(tài)分為3種。(1)分生孢子(conidium)：由生殖菌絲末端的細胞分裂或收縮形成，也可在菌絲側面出芽形成。按其形態(tài)和結構又可分大分生孢子和小分生孢子2種：大分生孢子(macroconidium)體積較大，由多個細胞組成，常呈梭狀、棍棒狀或梨狀。其大小、細胞數和顏色是鑒定的重要依據;小分生孢子(microconidium)較小，1個孢子只有1個細胞。真菌都能產生小分生孢子，其診斷價值不大。(2)葉狀孢子(thallospore)：由菌絲內細胞直接形成。①芽生孢子(blastospore),由菌絲體細胞出芽生成，常見于假絲酵母菌與隱球菌。一般芽生孢子長到一定大小即與母體脫離，若不脫離則形成假菌絲。②厚膜孢子(cla-mydospore),菌絲內胞漿濃縮，胞壁增厚，在不利環(huán)境中形成，抵抗力增大。當環(huán)境有利時，厚膜孢子又可出芽繁殖。③關節(jié)孢子(arthrospore)，在陳舊的培養(yǎng)物中，菌絲細胞壁變厚，形成長方形的節(jié)段，呈鏈狀排列。(3)孢子囊孢子(sporangiospore)：菌絲末端膨大成孢子囊，內含許多孢子，孢子成熟則破囊而出，如毛霉、根霉等。培養(yǎng)特性真菌的營養(yǎng)要求不高，在一般細菌培養(yǎng)基上能生長。檢查時常用沙保Sabouraud)培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基成分簡單，主要含有1%蛋白胨、4%葡萄糖和2%瓊脂，pH5.5。皮膚癬菌在此培養(yǎng)基上生長較慢，常需1~4周;但腐生性真菌在此培養(yǎng)基上生長迅速。故分離真菌時常在此培養(yǎng)基中加一定量的放線菌酮和氯霉素，前者用以抑制污染真菌，后者用以抑制細菌的生長。有些病原性真菌，如白假絲酵母菌、組織胞漿菌、新生隱球菌等加放線菌酮即不能生長，宜用無抗生素的血瓊脂平板，見有生長后移種沙保培養(yǎng)基，并同時做玻片培養(yǎng)以觀察自然狀態(tài)下的形態(tài)結構。培養(yǎng)真菌最適宜的酸堿度是pH4.0?6.0，淺部感染真菌的最適溫度為22?28℃。但某些深部感染真菌一般在37℃中生長最好。培養(yǎng)真菌需較高的濕度與氧。真菌的菌落有兩類：1.酵母型菌落是單細胞真菌的菌落形式，菌落光滑濕潤，柔軟而致密。形態(tài)與一般細菌菌落相似，如隱球菌即屬之。有部分單細胞真菌在出芽繁殖后，芽管延長不與母細胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為類酵母菌落，如假絲酵母菌。2.絲狀菌落是多細胞真菌的菌落形式，由許多疏松的菌絲體構成。菌落成棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正背兩面呈現不同的顏色。絲狀菌落的形態(tài)、結構和顏色常作為鑒定真菌的參考。真菌有從中心向四周等距離生長形成圓形菌落的傾向，所以臨床體癬、股癬、疊瓦癬等皮損表現為環(huán)形或多環(huán)形。若要真實地觀察菌絲與孢子生長的關系，可作小培養(yǎng)。系切取一小塊沙保培養(yǎng)基置玻片上，挑取小片真菌菌落接種在培養(yǎng)基周邊，蓋上無菌蓋玻片。培養(yǎng)1周后用乳酚棉藍(lactophenolcottonblue)染色。鏡檢可見菌絲和孢子的結構和排列。真菌容易發(fā)生變異。在培養(yǎng)基上人工傳代或培養(yǎng)時間過久，其形態(tài)、培養(yǎng)特性甚至毒力都可發(fā)生改變。抵抗力真菌對干燥、陽光、紫外線及一般消毒劑有較強的抵抗力。實驗證明紫外線對絲狀真菌與假絲酵母菌在距離1m照射需30min殺死。但不耐熱，60℃1h菌絲和孢子均被殺死。對2%石碳酸、2.5%碘酊、0.1%升汞或10%甲醛溶液較敏感。對常用于抗細菌感染的抗生素均不敏感;灰黃霉素、制霉菌素B、二性霉唑、克霉素、酮康唑、伊曲康唑等對多種真菌有抑制作用。第二節(jié)真菌的致病性與免疫性真菌引起機體感染同樣需要具備一定的毒力，如白假絲酵母菌、煙曲霉、黃曲霉的細胞壁糖蛋白有內毒素樣活性，能引起組織化膿性反應和休克，煙曲霉和黃曲霉還能致多種器官的出血和壞死。白假絲酵母菌具有粘附人體細胞的能力,隨著其芽管的形成，粘附力加強。二相真菌如莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌等進入機體后必須先轉換成酵母型在巨噬細胞中不被殺滅反而擴散。新生隱球菌的莢膜有抗吞噬作用。近來研究表明白假絲酵母菌和煙曲霉的熱休克蛋白HSP90與宿主細胞和血清蛋白結合能使之功能改變，是其能致病的一種原因。至今對真菌致病性研究僅限于少數幾種真菌。不同的真菌可通過下列幾種形式致病。1.致病性真菌感染主要是一些外源性真菌感染。淺部真菌如皮膚癬菌是由于這些真菌的嗜角質性，并能產生角蛋白酶水解角蛋白。在皮膚局部大量繁殖后通過機械刺激和代謝產物的作用，引起局部炎癥和病變。深部真菌感染后不被殺死，能在吞噬細胞中生存、繁殖，引起慢性肉芽腫或組織潰瘍壞死。2.條件致病性真菌感染主要是由一些內源性真菌引起的，如假絲酵母菌、曲霉、毛霉。這些真菌的致病性不強，只有在機體免疫力降低時發(fā)生，如腫瘤、糖尿病、免疫缺陷、長期應用廣譜抗生素、皮質激素、放射治療或在應用導管、手術等過程中易繼發(fā)感染。例如導管、插管入口為真菌入侵提供門戶，真菌粘附其上，并不斷增殖，從而進入血液，并播散至全身。.真菌超敏反應性疾病敏感患者當吸入或食入某些菌絲或孢子時可引起各種類型的超敏反應，如蕁麻疹、變應性皮炎與哮喘等。.真菌性中毒癥糧食受潮霉變，攝入真菌或其產生的毒素后可引起急、慢性中毒稱為真菌中毒癥(mycotoxicosis)。病變多樣，因毒素而異。有的引起肝、腎損害，有的引起血液系統(tǒng)變化，有的作用于神經系統(tǒng)引起抽搐、昏迷等癥狀。真菌中毒與一般細菌性或病毒性感染不同。真菌是在糧食中產生毒素，受環(huán)境條件的影響，所以發(fā)病有地區(qū)性和季節(jié)性，但沒有傳染性，不引起流行。糧食多次搓洗可以減少污染的毒素，有一定的預防作用。.真菌毒素與腫瘤的關系近年來不斷發(fā)現有些真菌產物和腫瘤有關，其中研究最多的是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素是一種雙呋喃氧雜萘鄰酮衍化物，毒性很強，小劑量即有致癌作用。根據熒光分析有20多種衍化物，其中B1致癌作用最強，B2次之。大鼠口服B1后易被吸收，在肝臟迅速達到高峰。B1與RNA和DNA結合能力很強，從而抑制細胞RNA與DNA的合成，與致癌有一定關系。在肝癌高發(fā)區(qū)的花生、玉米、油糧作物中，黃曲霉污染率很高，黃曲霉毒素含量可高達1ppm。大鼠試驗飼料中含0.015ppm即可誘發(fā)肝癌。也有人認為肝癌與乙型肝炎有關，經調查90%患者感染過乙型肝炎。故人肝癌的病因可能是多因素的，黃曲霉毒素只是重要因素之一。自然界中并非所有黃曲霉株都能產生黃曲霉毒素。事實上無毒株多于產毒株。相反，除黃曲霉外，寄生曲霉、黑曲霉、赤曲霉、溫特曲霉等也可產生黃曲霉毒素。其他致癌的真菌毒素還有赭曲霉產生的黃褐毒素也可誘生肝腫瘤，鐮刀菌T-2毒素可誘發(fā)大鼠胃癌、胰腺癌、垂體和腦腫瘤，展青霉素可引起局部肉瘤等。免疫性.天然免疫真菌感染的發(fā)生與機體的天然免疫狀態(tài)有關，最主要的是皮膚粘膜屏障。一旦破損、受創(chuàng)傷或放置導管，真菌即可入侵。皮脂腺分泌飽和和不飽和脂肪酸均有殺真菌作用。兒童頭皮脂肪酸分泌量比成人少，故易患頭癬。成人因手、足汗較多，且掌跖部缺乏皮脂腺故易患手足癬。在正常菌群中有細菌也有真菌。由于菌與菌之間的相互拮抗，不能大量生長引起疾病。長期應用廣譜抗生素破壞菌群間的比例，或因惡性疾病以及長期服用免疫抑制劑后，機體免疫力降低，均可引起繼發(fā)性真菌感染。此外，某些內分泌功能失調也是促使某種真菌感染的一種因素。如腎上腺皮質功能低下、糖尿病、甲狀腺功能低下等病人，常并發(fā)皮膚粘膜假絲酵母菌病。近年來發(fā)現tuftsin(真菌學上稱促癬吞噬肽)可結合到中性粒細胞外膜上以提高其吞噬和殺菌活性，并有促趨化作用?？拐婢兄行粤＜毎c巨噬細胞起重要作用，被真菌激活后釋放H2O2、次氯酸和防御素(defensin)能殺滅假絲酵母菌、煙曲霉等真菌。鐵對活細胞是必不可少的，但鐵濃度過高有助于細菌和真菌感染，如糖尿病酮中毒患者易發(fā)生毛霉病，低濃度不飽和轉鐵蛋白和高濃度血清鐵可誘發(fā)白假絲酵母菌感染。血漿中的轉鐵蛋白，經皮下小血管或汗腺擴散至皮角質層內，可限制數種真菌的生長。.獲得性免疫真菌感染因其胞壁厚，即使有抗體和補體也不能完全殺滅它。但特異性抗體可阻止真菌轉為菌絲相以提高吞噬率，并抵制真菌吸附于體表。如假絲酵母珠菌，SIgA抗體即可與其表面甘露聚糖復合體結合阻止其吸附。但一般認為真菌感染的恢復主要靠細胞免疫，真菌抗原剌激后特異性淋巴細胞增殖，釋放IFN-和IL-2等激活巨噬細胞、NK細胞和CTL等，參與對真菌的殺傷。播散性真菌感染患者常伴有T細胞功能的抑制，如AIDS、淋巴瘤和使用免疫抑制劑等。真菌感染可引發(fā)遲發(fā)型超敏反應。臨床上常見的癬菌疹就是真菌感染所引起的一種超敏反應。第三節(jié)真菌的微生物學檢查法各種真菌的形態(tài)結構有其一定的特殊性，一般可以通過直接鏡檢和培養(yǎng)進行鑒定，但具體方法應根據標本種類和檢查目的而異。標本淺部感染真菌的檢查可用70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標本。深部感染真菌的檢查可根據病情取痰、血液、腦脊液等標本。直接鏡檢和意義皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標本置玻片上。滴加10%KOH少許，以蓋玻片覆蓋后在火焰上微微加溫，使被檢組織中的角質軟化。輕壓蓋玻片，使標本變薄透明，然后在低倍或高倍鏡下檢查。若見菌絲或孢子，即可初步診斷患有真菌癬，但一般不能確定其菌種。皮膚癬標本檢查常用濕標本，不加染色。假絲酵母菌感染則取材涂片，行革蘭染色;隱球菌感染取腦脊液離心。沉淀物用墨汁作負染色后鏡檢。結果的判斷：①直接檢查陽性有意義，陰性不能排除感染。但陰道、痰等分離出假絲酵母菌、曲霉等條件致病菌需多次陽性才有意義。②組織中發(fā)現分隔分枝的菌絲多為曲霉;粗大、不分隔或不分枝的菌絲多為毛霉。假絲酵母菌出現假菌絲代表活動性，有意義。③皮膚癬菌菌絲肥大粗長，提示處于活躍狀態(tài)。④酵母型和二相型真菌在組織內常表現為孢子。分離培養(yǎng)直接鏡檢不能確診時應作真菌培養(yǎng)。皮膚、毛發(fā)、甲屑標本經70%乙醇或2%石炭酸浸泡2?3min殺死雜菌，無菌鹽水洗凈后接種于含放線菌酮和氯霉素的沙保培養(yǎng)基上，25?28C數日至數周，觀察菌落特征。必要時做小培養(yǎng)，于鏡下觀察菌絲、孢子特征進行鑒定。陰道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分離。若為血液需先增菌，腦脊液則取沉淀物接種于血平板上3