植物組織石蠟切片制作

植物組織石蠟切片的制作一、實驗?zāi)康?/p>

1．熟練掌握石蠟切片的方法。

2．掌握永久制片的制作過程，為研究植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

3．學(xué)會植物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的比較研究方法。

二、實驗器具與試劑

1．器具

石蠟切片機、烘箱、顯微鏡、染色缸、小培養(yǎng)皿、鑷子、毛筆、吸水紙、紗布、載玻片、蓋玻片等。

2．試劑

10%番紅水溶液、0.5%固綠（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸餾水、甘油、中性樹膠等。

三、實驗材料

幼嫩植物各部分，根據(jù)季節(jié)選擇材料。

四、實驗內(nèi)容與方法

石蠟切片法是顯微技術(shù)上最重要、最常用的一種方法。它是把材料封埋在石蠟里面，用旋轉(zhuǎn)切片機切片，可以切出很薄的切片。凡是精細的工結(jié)構(gòu)，大都用石蠟切片。全都過程如下：

1．固定2．洗滌3．脫水與硬化4．脫酒精2．封埋6．切片

7．粘片8．脫蠟9．染色10．脫水11.透明12．膠封

（一）固定

1．固定的意義：固定就是用藥品把細胞殺死，使細胞的原生質(zhì)凝固，死后不發(fā)生變化，盡可能保持原來的結(jié)構(gòu)以供我們觀察。良好的固定劑，應(yīng)是穿透力強，使細胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強折光率，并且不妨礙染色。

2．固定液的種類：固定液的種類很多，根據(jù)配制成分可劃分為：

(1)簡單固定液：以一種化學(xué)藥品配制的固定液。常用的簡單固定液有：

A．酒精即乙醇，用作固定液，常用純酒精或95％酒精。酒精穿透力強，固定時間常在1小時以內(nèi)。高濃度酒精有使材料收縮的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，絕不可用純酒精。酒精為還原劑，不能與鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等氧化劑配合。酒精可使核酸，蛋白質(zhì)及肝醣等發(fā)生沉淀，但能溶解脂肪及擬脂。

B．福爾馬林即甲醛，具強烈刺激性的氣味，純凈的甲醛，為無色透明液體。固定用的濃度為4-10％甲醛也是強還原劑。不能與鉻酸、鋨酸等氧化劑配合。經(jīng)固定后，材料變硬，通常不引起皺縮，但隨后經(jīng)過他種藥劑處理時，就每每出現(xiàn)皺縮。所以甲醛一般不單獨作固定，而與其他液體混合使用。

C．醋酸：為無色透明的液體，刺激性極強，冷則凝結(jié)成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以與水和酒精配成各種比例的溶液，所用濃度為0.2～5％，也常與其他固定劑配合使用。醋酸穿透性很強，單獨使用，有使原生質(zhì)膨脹的作用，故常與酒精，甲醛等合用，醋酸為固定染色體的優(yōu)良固定液，因此固定染色體的固定液中，幾乎都含有醋酸。

(2)混合固定液：由幾種藥劑，適量配制而成。常用的有下列幾種：

A、F.A.A固定液(又稱萬能固定液)：

[用途]這個固定液在植物研究上，應(yīng)用最多，為植物組織最常用的固定液。固定時間，不受限制，短為24小時，長可延至數(shù)月或數(shù)年。野外工作，非常便利。并且固定的材料，不妨礙染色，但對染色體的固定不佳。材料固定后，用50％酒精洗滌數(shù)次。

[配法]

50％或70％酒精90毫升

冰醋酸5毫升

福爾馬林5毫升

柔軟材料用50％酒精，堅硬材料用70％酒精配制。

B、卡爾諾氏(Carnoy's)固定液

[用途]此液作組織細胞的固定，有極快的滲透力，固定根尖和花藥只需40-60分鐘。固定后用95％酒精沖洗，在組織不能立即處理時，需轉(zhuǎn)入70％酒精中保存。配法有兩種：

C．納瓦興(Navaschjn's)固定液

[用途]此液在植物制片上應(yīng)用甚廣，是細胞學(xué)及組織學(xué)上一種優(yōu)良的固定液。此液原來的配方已很少應(yīng)用，現(xiàn)所用的都是改良液，且種類很多，如材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、Ⅱ；材料較堅硬，含水量較少，可用Ⅳ、V配方，其中配方Ⅱ?qū)χ参锱咛W(xué)制片特別適用。為了使用方便，常分別配成甲、乙兩種基液，用時臨時等量配合。固定時間為12-24小時，固定后用70％酒精洗滌數(shù)次。

(二)洗滌

材料固定后，藥劑繼續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必須用水或酒精洗去。用什么去洗，可根據(jù)三條原則：

1．凡用水溶液配制的固定液，特別是含有鉻酸、重鉻酸鉀的固定液，一律用水洗。

2．凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。

3．如固定液中含有苦味酸．在70％酒清中停留稍久時，可除去黃色。如用升汞固定的材料，在洗滌時，須加碘液，可除去汞的結(jié)晶。

（三）脫水與硬化

材料洗滌后，其中含水，水與石蠟不能混合，必須洗去。去水用酒精，材料由水入酒精中，不能操之過急，須由低度酒精漸至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％，每次須經(jīng)半小時，材料大的，時間須延長。若暫時不能埋蠟、材料可放在70％酒精中保存，經(jīng)久不壞。在高度酒精中，不能過久．因酒精能使材料硬化，過久則材料由硬而脆，切時易于粉碎。

（四）脫酒精

材料脫水后，材料中全含酒精，酒精與蠟也不能混合，仍須除去。脫酒精通常用二甲苯，材料由酒精入二甲苯，最好也漸次進行，先經(jīng)純酒精二甲苯混合液，再入純二甲苯中，純二甲苯須換一、二次才行。時間每次約半小時。二甲苯不僅脫去酒精，并且透明，所以又叫透明劑。

（五）埋蠟

埋蠟是把材料封埋在石蠟里面，便于切片。一方面材料太小太軟封在石蠟中，石蠟硬度適中，靠石蠟支持，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不僅材料外面包著蠟，材料內(nèi)面所有空隙也都充滿著蠟。這樣，材料的各部分都能保持原來的結(jié)構(gòu)與位置，切片不致發(fā)生破裂或其他變形。

所用石蠟，質(zhì)地必須純凈，溶點通常在48～56℃這個范圍內(nèi)，以52℃的石蠟用得更多。在材料不硬，天氣不熱時，宜用較低熔點的蠟。材料硬，天氣熱的情形下，宜用高溶點的蠟。

石蠟選定后，將石蠟切成小塊，置瓷皿中加熱溶蠟，待石蠟近于全部熔化時，置于溫箱中。在進行封埋的全部過程中，石蠟的溫度，總以高于溶點2℃為宜，過低石蠟?zāi)?，過高傷害材料。

材料脫酒精后，要進行浸蠟，再進行埋蠟。浸蠟也宜于漸次進行，一般先用石蠟和二甲苯的混合液浸蠟，再用純石蠟換一、二次，每次的時間，視材料大小而定，通常每次半小時，材料大，時間必須加長。在浸蠟的過程中，須注意溫度，不能超過2℃以上。浸蠟后，須將材料封埋在蠟塊中，通常以磅紙折成紙盒(如圖所示)。在盒內(nèi)底上，用軟鉛筆反書材料及日期等，然后把蠟倒入盒內(nèi)，將材料移入紙盒中，依將所要切的方向，妥善排列，再以兩手平持紙盒，移至冷水中，用口在蠟面上吹氣，促其凝結(jié)，待蠟面凝成簿層時，將紙盒全部沉入。水冷凝后，將紙撕去，即獲蠟塊，至此埋蠟完成。

折紙盒按下列順序折疊：

(1)折AA'及BB'；

(2)折CC'及DD'；

(3)折CE'與AE'、向外夾出EE'。同樣折出FF'，GG'及HH'；

(4)使CE'E與E'IE兩三角形相疊，并沿E'C和EI重疊的折痕向后轉(zhuǎn)折。同樣折其余三只角；

(5)折RIJF向外，同樣折出GKLH，即折成所需的紙盒。（六）切片

石蠟切片，用旋轉(zhuǎn)切片機。一個旋轉(zhuǎn)切片機，可分三個部分，一個是安裝切片刀的部分，有調(diào)節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個是安裝材料的部分，也有螺旋可以調(diào)節(jié)材料的位置。另一個是操縱在旋轉(zhuǎn)中向前推進的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復(fù)雜的部分。

切片步驟：

1．先將冷凝的蠟塊，切成小塊，粘固在小木頭上。

2．安裝切片刀，刀的斜度，非常重要，最好先切除的蠟塊試刀，以確定刀的斜度，一經(jīng)調(diào)度適合后，就不要隨便變動，以免每次試刀的麻煩。

3．修整蠟塊，刀片斜度調(diào)好后，將刀片移近蠟塊，使小蠟塊的下邊與刀鋒平行，然后把它固定，再轉(zhuǎn)下蠟塊．呈矩形才行。只有平整的蠟塊，才能切出平整的蠟帶。

4．最后根據(jù)需要，調(diào)整控制切片厚度的機制。調(diào)度后，把它固定下來。上述四步驟完成后，就可進行切片，將切出的蠟帶，平展于盒內(nèi)以供粘片。

（七）粘片

材料切成薄片后，須將切片粘在玻璃片上，加熱展開，這叫粘片。所用載玻片必須清潔才能使用。粘片時，需把膠液(或稱粘貼劑)置簿玻片上，再取切片，浮置膠液上，然后置烘片臺上，使切片展開燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時以記號筆在玻片上編號，放入溫箱中烘干，溫度30～40℃約1小時即干。常用的膠液有下列三種：

(1)明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡便優(yōu)良，配法是100毫升純水中，加明膠4毫克，加熱熔化，過濾即得。

(2)梅氏蛋白質(zhì)：

雞蛋清50ml

甘油50m1

水楊酸納1g

用蛋白與甘油攪拌，同時加入水楊酸納，調(diào)勻過濾，應(yīng)用時以濾液15滴，放入純水50毫升中即得。

(3)Land氏液：

阿拉伯膠1克

重鉻酸鉀0.2克

純水100毫升

（八）脫蠟

玻片烘干后，須將蠟脫去，才能染色，脫蠟用二甲苯，再經(jīng)酒精入水中，而后染色，其順序如下：

二甲苯→1/2二甲苯十1/2純酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色

以上各級約需5～10分鐘。

（九）染色

染色的方法很多，視研究目的加以選擇?，F(xiàn)就研究植物組織和研究細胞分裂常用的兩種染色方法介紹如下：

1．番紅與固綠色法

番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步驟如下：

討論和注意點：

(1)用番紅和固綠這個組合染成的切片，木化、栓化和角質(zhì)的細胞壁，被番紅染成鮮紅色，纖維素的細胞璧，被固綠成綠色。就維管束來講，木質(zhì)部染紅，韌皮部染綠，區(qū)別極清楚。

(2)在50％酒精中脫色，需經(jīng)實踐，如脫色不夠，綠色難得染好，脫色太過分，做出來的切片，紅色太淡，甚至于全是綠色，失掉了二色染法的用意。

(3)染色時間，不是絕對的，常因材料種類，切片的厚簿而不同，在沒有把握時，最好選用少數(shù)材料試染，試染成功后，再依次大批染色。

2．海氏鐵礬—蘇木精染色法：

海氏鐵礬—蘇木精染色法的特點，是在染蘇木精以前，用鐵明礬做媒染劑，在染蘇木精以后，又用鐵明礬液鑒定(脫色或分色)。

所用鐵明礬液，為2～4％的水溶液，此液須在用前數(shù)日臨時配制。配成后不能見光，須置暗處，或用有色玻瓶裝。也不能保存太久，大約二月內(nèi)可用，用時，每次更換。

所用蘇木精液，為0.5％的水溶液。此液配成后，須經(jīng)1～2月，待它氧化成熟以后才能應(yīng)用，故必須先配制。蘇木精在水中溶解很慢，約需10日才能完全溶解，若需用不急，可直接用蒸餾水配制。若想加速溶解，可先用酒精溶解，再加入蒸餾水。蘇木精0.5克

酒精10毫升

蒸餾水90毫升

染色步驟如下：

此染色法在細胞學(xué)及胚胎學(xué)制片上應(yīng)用很廣，是顯示細胞一般結(jié)構(gòu)及細胞分裂的優(yōu)良染色液，染色結(jié)果可使染色體呈蘭黑一—紫色，細胞質(zhì)染成淺蘭色或淺灰色。在染色過程中所需注意的是：①分色后，用水洗凈鐵礬液，最好用流水，如無流水，須多更換水。若沖洗不凈，將來繼續(xù)褪色。②在鐵礬液中分色，須時常取出在顯微鏡下檢查，到細胞質(zhì)的染色很淡即止。

（十）脫水、透明、膠封

脫水用酒精，由低濃度酒精至高濃度酒精依次進行，最后入純酒精更換一次，用二甲苯透明，用樹膠封片，其步驟與前面所述永久制片相同。樣品處理方法：首先要盡量保持生物材料的天然狀態(tài)，避免贗像、變形和失真，因此須將生物材料做固定處理；制片必須薄而透明，才能在顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地觀察到結(jié)構(gòu)的細節(jié)。需長期保存的制片，還應(yīng)進行脫水和封固。

顯微制片法一般包括切片法、整體封片法、涂片法和壓片法4類。①切片法。光學(xué)顯微鏡的切片厚度在2～25微米之間，一般動植物材料的切片以厚10微米左右為合適。切片法根據(jù)包埋劑的不同而有所不同。常用的是石蠟切片法、棉膠切片法、冰凍切片法、乙二醇甲基丙烯酸脂法(簡稱GMA法)。石蠟切片法包括固定、包埋、切片、染色、脫水和封固等步驟。關(guān)鍵是把生物材料用石蠟包埋，以石蠟為支持物，把浸在蠟塊中的生物材料切成理想的薄片。操作過程為：固定→水洗→從低濃度逐級到高濃度酒精脫水→二甲苯透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→二甲苯脫蠟→逐級從高濃度到低濃度酒精處理，最后過渡到水→染色→逐級從低濃度到高濃度酒精脫水→二甲苯