RTPCR原理與實驗操作步驟講解行業(yè)資料實驗

先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸g110.00Trizol100ml/1先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸g110.00Trizol100ml/1瓶Invitroge高壓（不需要泡DEPC）三、試劑配制：DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml RT-PCR原理與實驗操作步驟關鍵詞：RT-PCR逆轉錄酶鏈式反應引物設計DNA聚合酶一、知識背景：單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105mRNA表達水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應，其特異性由兩個人工合成的引物序列決A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結BE稀釋10倍成0.5TBEBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度一、實驗器具與材料：移液槍：1ml、200μ20μ10μ2μ中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設計原則的把C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs與Mg2＋存在下，退火引C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs與Mg2＋存在下，退火以上三步為一個循環(huán)，如此反復。3、逆轉錄酶和RT-PCR的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：1、引物的設計與其原則：1）引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關重要的影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以與可能存在的hnRNA對引物的特異性′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′pC′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′pC過夜，再烤干）...勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再板合成cDNA第一條鏈；Rnase水解活性：水解RNANA雜515.377.231七、引物合成科威）正義：5′-CACG的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設計原則的把握：引物設計原則包括特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值4060PCR擴增的復性溫度一般是較用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。d、引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結構或引物自身復性。e、引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)/μl0.3μl(1μ/μl0.3μl(1μl)10pmol...下游引物10pm5%乙醇（用DEPC水配）1ml...↓4℃離心7500g，鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：引物混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30- f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續(xù)8個的互補堿基存在。使PCR產(chǎn)物的末端結合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。根據(jù)實驗目的選擇適當?shù)囊?。常用引物設計軟件如2、耗材：實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。3、試劑準備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。三、RNA的提取方法：RT－PCR中從細胞分離的RNA的質量至關重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源ATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′...反義：5DEPC水1鋁制飯盒：ATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′...反義：5DEPC水1鋁制飯盒：4個1塑料小飯盒：1個1大瓷缸：2個1中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設計原則的把必須按總體積的1/5）顛倒混勻10下，室溫5分鐘↓4℃，離心 性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。實驗操作步驟1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）級結構：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3'端不應超過口，帶蓋）1級結構：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3'端不應超過口，帶蓋）1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）量筒：50基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3容量瓶中靜置4小時備用。75%乙醇：用無水乙醇DEPC水配， 另一個裝DEPC水16、三角燒瓶：帶蓋，稍大二、實驗器具的處理與準備1、塑料制品包括槍頭、EP管、勻漿管等）先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡管）水泡）（洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干）NA剪切方式以與可能存在的hnRNA對引物的特異性...的影級結構：兩引物之間不應有多于NA剪切方式以與可能存在的hnRNA對引物的特異性...的影級結構：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3'端不應超過、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結合。...），如取50ml貯存液450ml水--→500ml工作緩沖液 3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。2、75%乙醇：用無水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）3、異丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、瓊脂糖0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml：250ml、500ml各2：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝物。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等mM0.2μl(0.5μl)<200uM上游引物10pmol盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源...性RNA酶污 再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即），緩沖液2、上樣緩沖液：0.25%溴酚藍0.25%二甲苯青FF30%甘油1、1.0%：充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進行電泳。），如取50ml貯存液450ml水），如取50ml貯存液450ml水--→500ml工作緩沖液515.377.231七、引物合成科威）正義：5′-CACGse）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少8.0蒸溜水1000ml...5×TBE（貯存液）再將5×T六、需購置的RT-PCR材料：---20℃DEPC5g110.00--4℃七、引物合成科威）正義：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′合體中的RNA；依賴DNA的DNA合體中的RNA；依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：引物高壓（不需要泡DEPC）三、試劑配制：DEPC水：吸出1ml：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝 反義：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′正義：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′反義：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′3、退火溫度計算2（AT）4（GC）4、引物各合成5OD，每OD一瓶分裝好先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描打印。握：引物設計原則包括a、引物長度:一般為15握：引物設計原則包括a、引物長度:一般為15～30bp，引物鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：引物勻10下，室溫5分鐘...↓加氯仿1/5體積（0.2ml）（板合成cDNA第一條鏈；Rnase水解活性：水解RNANA雜 2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。3、RNA抽提前，打開離心機預冷。TRIzol法抽提總RNA組織100mg↓細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊↓勻漿（要徹底，后轉至EP管）（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）↓顛倒混勻10下，室溫5分鐘Buffer)RNasin:1支110---20℃DEPC5Buffer)RNasin:1支110---20℃DEPC5mM0.2μl(0.5μl)<200uM上游引物10pmol12000g，15分鐘↓轉上層水相（約400μl）于另一1.物沿5'3'方向延伸。以上三步為一個循環(huán)，如此反復。逆轉錄酶↓顛倒混勻10下，室溫5分鐘↓↓↓↓↓棄上清↓加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)管）（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)管）（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）↓顛倒混CR...（第一步：逆轉錄反應）試劑濃度體積終濃度RNA23何二級結構的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居↓↓棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至1、RNA若用于核酸轉移應溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC溶解至可一年以上）可保存一年兩步法RT-PCR鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：引物鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準備：引物凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處口，帶蓋）1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）量筒：50瓶中氯仿：放入棕色瓶中瓊脂糖四、幾種緩沖液的配制：電泳緩沖液（第一步：逆轉錄反應）試劑濃度體積終濃度（稀釋10倍后用）↓↓立即冰水浴，稍離心↓試劑濃度體積終濃度dNTP10mM2μl(1μl)0.5mM放在1000ml雙蒸水中配成1‰放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml60min↓95℃10min（破壞MLV）↓4℃保存兩步法R45min后現(xiàn)進行電泳。1.5%:同上，將瓊脂糖的量改為1.