一種強化微生物降解多環(huán)芳烴的方法及微生物菌劑與流程

一種強化物降多環(huán)芳烴法及生物劑與1.本發(fā)明涉及種強化微生物降多環(huán)芳烴的方法，于環(huán)境污染生物理技術領域，主要用廢水、土壤等多芳烴污染環(huán)境的復處理。背技：2.多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)是土壤沉積物、水和大氣環(huán)境中廣泛出的污染物，主來源于人類活動包括化石燃料不完燃燒、工業(yè)排放、車尾氣等。環(huán)境的多環(huán)芳烴污染有致癌、致畸和誘作用，對人類健康成潛在風險。多芳烴污染修復是利于人體健康和生系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的要環(huán)境問題。3.微生物修復一種成本低、效好和環(huán)境友好的修方法。但是直接污染土壤等環(huán)境中投降解菌的修復方，降解菌活性低降解效果不理想。4.中國專利申公開號為cn104492804a的有技術公開了臭氧處理強化微生物降解修復污染壤的系統(tǒng)及方法針對多環(huán)芳烴污土壤，首先采用臭預處理，再向反應器中添加生物表活性劑和液態(tài)培基、進行聯(lián)合降解定期取樣測定直至復完成。其采用氧預處理和生物面活性劑增溶技術強化微生物降解聯(lián)技術，克服了單技術的局限性，操作簡便，成本低，運行周期短，去效果好，多環(huán)芳的去除率達93％以上，且不產(chǎn)生二污染，大大削弱了環(huán)芳烴污染土壤人體和環(huán)境的危，為土壤修復提供新的思路。充分利了臭氧預處理、物表面活性劑增強化以及土著微生自身降解作用的相合，使得各種技互為補充，臭氧處理使得后端生物解的修復效果得以高，多環(huán)芳烴的除率達93％以上，同時也縮短了修周期。該方法對多芳烴污染土壤進臭氧預處理的步在實驗室中容易實，但其難以適用于接針對大面積受染的土體的原位理。技實要素：5.1.要解決的題6.針對現(xiàn)有技中微生物降解多芳烴的效率有限的術問題，本發(fā)明供一種強化微生物降多環(huán)芳烴的方法通過利用陽離子性蒙脫土調節(jié)微生關鍵酶活性以及礦-微生物界面生物化學過程，從而強微生物生長代等生命活動，進而高污染物的降解率7.2.技術方案8.一種強化微物降解多環(huán)芳烴方法，包括將微生接種于陽離子改蒙脫土的步驟；所述生物包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中國普微生物菌種保管理中心，保藏cgmcc1.10964。本發(fā)明通過利用陽離子性蒙脫土調節(jié)微物提供微生物生介質，表面陽離子響關鍵酶活性以及物-微生物界面生物化學過程，從而強微生物生長代等生命活動，進而高污染物的降解率9.優(yōu)選地，所陽離子改性蒙脫包括fe(iii)改性蒙脫土、co(ii)改性蒙脫土、na(i)改性蒙脫土中一種或多種，特優(yōu)選fe(iii)改性蒙脫土。10.優(yōu)選地，所述環(huán)芳烴包括芘、并[a]芘、菲、熒蒽、蒽中的一種多種。[0011]優(yōu)選地，具體包以下步驟：[0012]s1采用滅菌營肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)擴繁mycobacteriumsp.njs-1菌，隨后用滅ph7.0磷酸鹽緩沖液清洗液并調節(jié)細菌數(shù)或細菌密度達到特定值；[0013]s2向陽離子改蒙脫土中加入滅無機鹽培養(yǎng)基，后接種步驟s1所述mycobacteriumsp.njs-1菌；[0014]s3將接種菌后陽離子改性蒙脫與含有多環(huán)芳烴污染物在適當條件混合培養(yǎng)，降解多環(huán)烴；[0015]或[0016]s1采用陽離子性蒙脫土吸附固含有多環(huán)芳烴的染物；[0017]s2采用滅菌營肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)繁mycobacteriumsp.njs-1菌，隨后用滅ph7.0磷酸鹽緩沖液清洗液并調節(jié)細菌數(shù)或細菌密度達到特定值；[0018]s3向吸附有污物的陽離子改性脫土中加入滅菌機鹽培養(yǎng)基，隨后種步驟s2所述mycobacteriumsp.njs-1菌在適宜條件混合培養(yǎng)，降解環(huán)芳烴。[0019]優(yōu)選地，通過離交換法制備陽離飽和改性蒙脫土選取蒙脫土k10，研磨過篩，所述過篩篩孔大小為不小200目。[0020]優(yōu)選地，所述陽子改性蒙脫土通離子交換法制備具體包括：[0021]a)蒙脫土與金陽離子的氯化物液固液比為1:20；[0022]b)金屬陽離子量濃度為0.1n；[0023]c)采用離子交法，交換次數(shù)不于2次；[0024]d)每次交換震平衡時間不小于2h；[0025]e)交換完成后用超純水清洗4次以上直無cl-。[0026]優(yōu)選地，所述降菌為mycobacteriumsp.njs-1，分離自多環(huán)芳污染農(nóng)田，能以芘為唯一碳源長，并能降解苯a]芘、菲、熒蒽、蒽等[0027]優(yōu)選地，所述降菌mycobacteriumsp.njs-1擴繁條件包括好氧培養(yǎng)，在滅營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基接種適量菌液，℃和160rpm避光件下培養(yǎng)過夜；滅菌ph7.00.1m磷酸鹽緩沖液清兩次，調整菌密度為od600＝0.30。[0028]優(yōu)選地，所述步s2或s3降解體系改性蒙土與無機鹽培養(yǎng)固液質量比為1:(20～100)，mycobacteriumsp.njs-1菌株接種稀釋od600不小于0.03。[0029]優(yōu)選地，相對于添加鐵離子改性脫土的原始菌密，鐵離子改性蒙脫使mycobacteriumsp.njs-1菌種的菌密度1～3d內提高3倍以上。[0030]一種微生物菌劑包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中國普微生物菌種保管理中心，保藏cgmcc1.10964；還包括鐵離子改性蒙脫。陽離子改性蒙土能夠顯著促進解菌mycobacteriumsp.njs-1生長，提高關鍵酶性以及生物電化活性。[0031]優(yōu)選地，所述鐵子改性蒙脫土中離子的交換率在50％～100％范內。[0032]3.有益效果[0033]相比于現(xiàn)有技術本發(fā)明的有益效為：[0034](1)蒙脫土特有的比表面積及孔隙構能影響微生物的布、調節(jié)微生物性，并緩解不利環(huán)(重金屬、有機染物等)對微生物造成的脅壓力；蒙脫土與微生物的相互作可以獲得更好的存競爭力和更有的微生物活性，從在一定程度上強化目標污染物的生修復作用；陽離改性蒙脫土具有親特征，具有較強“離子-π鍵”交互作，有利于微生物污染物的附著和布；本發(fā)明通過利陽離子改性蒙脫土節(jié)微生物關鍵酶性以及礦物-微生物界面生物化學過程，基于脫土、微生物及環(huán)芳烴的相互作用利用蒙脫土表面固的陽離子調節(jié)礦電化學特性，促微生物在礦物表面長形成生物膜，提微生物-礦物-污染物間的生物化學過程，達到化微生物降解多芳烴的目的；[0035](2)本發(fā)明的鐵離改性蒙脫土用于化微生物降解多環(huán)烴具有突出的效，這可能是由于fe是一氧化還原蛋白的基，通過自身價變化來調控酶性以及傳遞電子，時可以作為胞外子受體，在微生-礦物界面生物電學過程中發(fā)揮重作用；從菌密度增長可以得知鐵離改性蒙脫土對微生具有較強親和力能夠促進微生物長；從過氧化物酶性、雙加氧酶活及電子傳遞活性果可以得知，鐵子改性蒙脫土能夠效強化微生物氧化原酶和生物電化活性；[0036](3)本發(fā)明的鐵離改性蒙脫土和微物共培養(yǎng)后，制作微生物菌劑，操簡單，不產(chǎn)生二次染，鐵離子改性脫土對微生物生化學過程具有顯著促進作用，菌劑可用于土壤和污水環(huán)境原位生物修。附圖說明[0037]圖1為本發(fā)明實施1中不同陽離子改性蒙脫土存下接種微生物()和不接種微生物(-)條件下降解芘的力學曲線(芘初始濃度15mg/l)，mt為改性蒙脫土在接菌條件下的處理[0038]圖2為本發(fā)明實施1中不同陽離子改性蒙脫土存下培養(yǎng)不同時間微生物對芘的降解率(芘始濃度100mg/l)，其中blank為接種菌且不加蒙土的處理，mt為未性蒙脫土且未接種的處理；[0039]圖3為本發(fā)明實施2中不同陽離子改性蒙脫土存下芘降解過程中a：菌密度變化；b：過氧物酶活性變化；c：雙加氧活性變化；d：菌密度芘降解率的關系；e：過化物酶活性與芘解率的關系；f：雙加氧酶活性與降解率的關系；[0040]圖4為本發(fā)明實施2中不同陽離子改性蒙脫土存下芘降解過程中生物電化學活性(a:電子遞活性及b：電子傳遞容量)變化其與芘降解的關。具體實施方式[0041]除非另有定義，文所使用的所有技術和科學術語屬于本發(fā)明的技術域的技術人員通常解的含義相同；文所使用的術語“和/或”包括個或多個相關的所列項目任意的和所有的合。[0042]實施例中未注明體條件者，按照規(guī)條件或制造商議的條件進行。所試劑或儀器未注明產(chǎn)廠商者，均為以通過市售購買得的常規(guī)產(chǎn)品。[0043]濃度、量和其他值數(shù)據(jù)可以在本中以范圍格式呈。應當理解，這樣范圍格式僅是為了便和簡潔而使用并且應當靈活地釋為不僅包括明確述為范圍極限的數(shù)值，而且還包括蓋在所述范圍內所有單獨的數(shù)值子范圍，就如同每數(shù)值和子范圍都被確敘述一樣。例，約1至約4.5的數(shù)值范圍應當解釋為不僅包括明確敘的1至約4.5的極限值，且還包括單獨的字(諸如2、3、4)和子范圍諸如1至3、2至4等)。同的原理適用于敘述一個數(shù)值的范圍，諸如“于約4.5”，應當將其解釋為括所有上述的值范圍。此外，無論所描述范圍或特征的廣如何，都應當適這種解釋。[0044]以下結合附圖和例對本發(fā)明的具實施作進一步說，但本發(fā)明的實施和保護不限于此。需出的是，以下若未特別詳細說明過程，均是本領域術人員可參照現(xiàn)有術實現(xiàn)或理解的所用試劑或儀器注明生產(chǎn)廠商者，為可以通過市售購得到的常規(guī)產(chǎn)品[0045]作為舉例，以下施例中采用芘和枝桿菌mycobacteriumsp.njs-1進行實驗。所菌株是以芘為唯碳源的降解菌，自中國普通微生菌種保藏管理中心，革蘭氏陽性菌。[0046]實施例1[0047]一、陽離子改性脫土的制備[0048]陽離子改性蒙脫制備過程，包括下步驟，具體為[0049](1)蒙脫土的前處[0050]將蒙脫土研磨，200目尼龍篩。[0051](2)離子交換法制陽離子改性蒙脫[0052]稱取3.0g蒙脫置于一系列100ml離心管中，別加入60ml超純水超分散清洗兩次，隨后入60ml當量濃度為0.1nnacl,cucl2，，nicl2，fecl3，加蓋后于25℃，160rpm震蕩平衡2h，然后4000rpm心10min，棄去上清液，分別再加入60ml0.1n上述金屬離子溶液，在25℃，160rpm震蕩平衡2h，以達蒙脫土完全被陽離子飽和的的。樣品離心后棄上清液，加入60ml超純水蕩清洗5min，然后4000rpm離心10min，去上清液，相方法再重復清洗3次以洗去弱結合態(tài)離子和cl-離子。樣品60烘干，研磨過200目尼龍篩制得不同陽離子飽改性蒙脫土，儲存于玻璃劑瓶備用。改性脫土中陽離子含及交換率如表1所示。[0053]表1改性蒙脫土金陽離子含量(mg/kg)及交換[0054][0055]二、多環(huán)芳烴污陽離子改性蒙脫[0056]使多環(huán)芳烴與陽子改性蒙脫土混，包括以下步驟具體為：[0057]稱取0.2g第一中陽離子改性蒙土于50ml玻璃離心管，加入0.4ml丙酮配置的芘溶液(濃度500mg/l或5000mg/l)，輕輕勻，然后靜置與風櫥中，待丙酮完全揮發(fā)制得芘含量為1mg/g或10mg/g的污蒙脫土。[0058]三、降解菌的培擴繁[0059]降解菌的活化和繁，降解菌為mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中國普微生物菌種保管理中心，保藏cgmcc1.10964。該菌分離篩選自多環(huán)芳污染農(nóng)田，能夠芘為唯一碳源和源生長?；罨蛿U包括如下步驟，具為：[0060]將保存于-80℃甘油中的解菌解凍，接種滅菌的營養(yǎng)肉湯培基中，接種比例每100ml培養(yǎng)基接0.2ml保藏液，隨后于28，160rpm好氧避光培養(yǎng)過，待菌株生長至對數(shù)，取出，轉移至菌離心管中5000rpm離心收集下菌體，然后采用滅菌磷鹽緩沖液(ph7.0)清液2次，新懸浮后調節(jié)細密度使得od600＝0.30,菌數(shù)量約為1.6×108cfu/ml。[0061]四、陽離子改性脫土表面芘的微物降解實驗[0062]陽離子改性蒙脫表面芘的微生物解，包括如下步，具體為：[0063]在50ml玻璃離管中向第二項所芘污染的改性蒙脫中加入滅菌無機培養(yǎng)基，隨后接種第項中降解菌，接后使細菌密度od600不小于0.03。降解體系中改性蒙脫土無機鹽培養(yǎng)基溶質量比為1:50(1:20～1:100均)。然后置于28℃，160rpm恒溫搖床光培養(yǎng)。培養(yǎng)不時間后采用有機劑提取，高效液相色譜(hplc)法定提取液中剩余的含量，繪制降解力學曲線(圖1)，并計算芘解率。如表2所示，零級力學和一級動力均能較好表征芘降解規(guī)律。芘(c015mg/l)在5天內降解率達95％以上，fe(iii)改性蒙脫土處理效果最優(yōu)在3天后降解率達到93.6％，其為na(i)和co(ii)性蒙脫土的處理，5天降解率均高于95％。如圖2，當濃度增大到100mg/l時，fe(iii)、co(ii)、改性蒙脫土處理在16天內降解率達95％以上，而不加蒙脫的處理降解率僅不到60％。以上結果說明陽離子改的蒙脫土(特別是fe(iii)性蒙脫土)處理夠顯著強化芘的生物(mycobacteriumsp.njs-1)降解效果。某些對微生物生和代謝不利的陽離如cu(ii)、ni(ii)等陽離子改性蒙脫土抑制該降解菌對的降解。[0064]表2陽離子改性蒙土表面芘微生物解動力學參數(shù)(c0＝15mg/l)[0065][0066]實施例2[0067](一)陽離子改蒙脫土促進微生物生長的究[0068]陽離子改性蒙脫促進微生物生長研究，包括如下驟，具體為：[0069]采用實施例1的方構建微生物-礦物(mycobacteriumsp.njs-1-陽離子改性蒙脫土降解芘(c0＝15mg/l)的培體系，在培養(yǎng)第1天和3天分析微生物生長狀，采用方法為平計數(shù)法，具體過為：吸取0.1ml培養(yǎng)液于9ml無菌水中，勻，通過逐級稀法稀釋樣品，稀釋至104和倍，別吸取0.1ml稀釋后的品接種到無菌營肉湯固體培養(yǎng)基，涂布均勻后的養(yǎng)皿倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后對形成的菌落進計數(shù)，獲得細菌長密度變化。結如下(圖3a)：培養(yǎng)1天和3天后，相對于添加鐵離子改性脫土的原始菌密度陽離子改性蒙脫的處理cfu較接種分別增長了3～4倍和8～10倍，與芘降解率密切關(圖3d)，表明離子改性蒙脫土進了降解菌的生，其中fe(iii)改性蒙脫土的強化處理效最好。[0070](二)陽離子改蒙脫土強化微生降解酶活性的研究[0071]陽離子改性蒙脫強化微生物降解活性的研究，包如下步驟，具體為[0072]采用實施例1的方構建微生物-礦物(mycobacteriumsp.njs-1-陽離子改性蒙脫土降解芘(c0＝15mg/l)的培體系，在培養(yǎng)第1、3、5天測定雙加氧酶活性和子傳遞活性及容，具體方法如下[0073](1)過氧化物酶活：具體過程為：取0.2ml樣品液，加入2ml含有5mm的二羥基苯丙氨酸(-dopa,ph7.0pbs緩液配制)和0.1％h2o2，在28℃下養(yǎng)1.5小時后，用光光度法在460nm波長檢測產(chǎn)物的生量(ε460＝37000m-1cm-1)。結果顯示圖3b)：不同陽離子改性蒙脫的處理過氧化物活性隨芘降解呈現(xiàn)不同的變規(guī)律，fe(iii)改性蒙脫土的理過氧化物酶活始終處于較高的水平。[0074](2)雙加氧酶活性(兒酚2,3雙加氧酶catechol2,3-dioxygenase，c23o)具體過程為：吸0.2ml樣品液，加入1ml有0.5mm的兒茶酚(pbs沖液配制，ph7.0)在28下培養(yǎng)4小時后，用分光度法在375nm波長下檢產(chǎn)物的生成量(ε375＝36000m-1cm-1)。結果顯示圖3c)：隨著芘的逐漸降解，加氧酶活性升高降解第5天酶活性達到最大其中fe(iii)和na(i)改性蒙土的處理雙加氧活性最大。[0075]通過相關分析可發(fā)現(xiàn)芘降解過程細菌過氧化物酶性與芘降解率(圖3e)，以及雙加氧酶活與芘降解率(圖3f)具有顯的相關關系，表明高關鍵酶活性是陽離子改性脫土增強芘降解一個主要途徑。[0076](三)陽離子改蒙脫土強化微生生物電化學活性研[0077]陽離子改性蒙脫強化微生物生物化學活性研究，括如下步驟，具體：[0078]采用實施例1的方構建微生物-礦物(mycobacteriumsp.njs-1-陽離子改性蒙脫土降解芘(c0＝15mg/l)的培體系，在培養(yǎng)第1、3、5天測定雙加氧酶活性和子傳遞活性及容，具體方法如下[0079](1)電子傳遞活性(electrontransportsystemactivity，etsa)：吸0.5ml樣品液，加入0.5mlpbs沖液(ph7.0)0.5ml碘硝基四唑紫(int，0.1)，30℃避光培養(yǎng)培養(yǎng)結束后加入5ml甲醇止反應，提取產(chǎn)甲臜(intf)，然后采用分光度計490nm處測定產(chǎn)物吸光度根據(jù)標準曲線計產(chǎn)物intf。電子傳遞活性以單時間內生成的intf來表示。果顯示(圖4a)，na(i)改性蒙脫土處理電子傳活性隨芘降解而加，而fe(iii)改性蒙脫土處理下降趨勢，總的來說fe(iii)性蒙脫土的處理子傳遞活性高na(i)改性蒙脫土，這可能是由于fe是一氧化還原蛋白的基，通過自身價變化來調控酶性以及傳遞電子，時可以作為胞外子受體，在微生-礦物界面生物電學過程中發(fā)揮重作用，因此，鐵子改性蒙脫土界面降解速度更快。[0080](2)電子傳遞容量采用電化學工作，記錄樣品電流時(i-t)曲線，測量品供電子能力(edc)。體過程如下：向解池中加入9mlpbs緩沖液(ph7)和0.1m的kcl，平衡所的氧化還原電位至0.61v，隨后加入0.1ml的電子轉移質abts(10mm)出氧化峰電流，再達到恒定的背景電后，向電解池中入0.1ml樣品液，現(xiàn)樣品氧化峰電流通過如下公式計樣品電子供給能力[0081][0082]其中v為樣品體積iox為基線校正后的氧化電，f為法拉第常數(shù)(f＝96485cmol-1)，edc單位μmole-ml-1。結果顯示(圖4b)：陽離子改性蒙脫土-微生物降解系統(tǒng)有較高電子供給力，隨芘降解先高后降低，fe(iii)改性蒙脫土的處理電供給能力初期稍于na(i)改性蒙脫土，但在后期相反。結果說明隨著芘解，降解系統(tǒng)供子能力先增加后小。結合以上結果以得知，陽離子改蒙脫土通過調控解酶活性和生物化學活性強化芘降。[0083]以上結果表明fe(iii)co(ii)、na(i)金屬陽離子改性脫土能夠通過促微生物生長和關酶代謝活性，促礦物-微生物間的電子遞等生物電化學程，進而強化對環(huán)芳烴(芘)的降解，其中以fe(iii)改蒙脫土的強化效果好，在土壤污染復中具有較好的應潛力。[0084]在一些實施例中陽離子改性蒙脫強化微生物降解用采用如下的方法實現(xiàn)：[0085]s1采用滅菌營肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)繁mycobacteriumsp.njs-1菌至細菌數(shù)量細菌密度達到特值；s2向陽離子改性蒙脫土中加滅菌無機鹽培養(yǎng)基，隨接種步驟s1的mycobacteriumsp.njs-1菌；s3將接菌后的陽離子改蒙脫土加入含有多芳烴的污染溶液行混合培養(yǎng)，降解多芳烴，例如芘，對于單獨的mycobacteriumsp.njs-1菌直接用于降芘，具有更高的解率；且相對于改性的蒙脫土與mycobacteriumsp.njs-1菌混合后降解，具有更高的降率。[0086]在一些實施例中采用不同批次制的鐵離子改性蒙土來強化微生物降作用，其中鐵離子交換率在50～100％范圍，相對于單獨的mycobacteriumsp.njs-1菌直接用于降芘，具有更高的解率；且相對于改性的蒙脫土與mycobacteriumsp.njs-1菌混合后降解，具有更高的降率。[0087]以上實施例僅為發(fā)明較優(yōu)的實施式，僅用于解釋發(fā)明，而非限制本明，本領域技術員在未脫離本發(fā)精神實質下所作改變、替換、修飾均應屬于本發(fā)明的護范圍。技特：1.一種強化微物降解多環(huán)芳烴方法，其特征在于包括將微生物接于陽離子改性蒙脫土步驟；所述微生包括mycobacteriumsp.njs-1，保藏于中國普微生物菌種保管理中心，保藏cgmcc1.10964。2.根據(jù)權利要求1所述的化微生物降解多芳烴的方法，其特在于，所述陽離改性蒙脫土包括fe(iii)、co(ii)或na(i)改性蒙脫土的一種或多種。3.根據(jù)權利要求2所述的化微生物降解多芳烴的方法，其特在于，所述多環(huán)烴包括芘、苯[a]芘、菲、熒蒽、蒽中的種或多種。4.根據(jù)權利求1所述的強化微生物降多環(huán)芳烴的方法其特征在于，包以下步驟：s1采用滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基養(yǎng)擴繁mycobacteriumsp.njs-1菌，隨后調節(jié)菌數(shù)量或細菌密達到特定值；s2向陽離子改性蒙土中加入滅菌無機鹽培基，隨后接種步s1所述mycobacteriumsp.njs-1菌；s3將接菌后的陽離子改蒙脫土與含有多環(huán)烴的污染物在適條件下混合培養(yǎng)，降多環(huán)芳烴；或s1采用陽離子性蒙脫土吸