菠蘿蜜種子中凝集素的提取及其生物學(xué)特性研究

菠蘿蜜種子中凝集素的提取及其生物學(xué)特性研究

海南島位于熱帶地區(qū)，擁有豐富的熱帶植物資源，尤其是熱帶果樹資源。凱羅蜜是著名的水果之一。它的果肉深受人們喜愛，每年的銷售額也顯著增加。然而，在食用凱羅蜜后，剩下的種子被丟棄，造成了巨大的浪費(fèi)和污染。研究發(fā)現(xiàn),許多植物體內(nèi)均含有豐富的凝集素,目前已分離鑒定的凝集素有伴刀豆凝集素、麥胚凝集素(WGA)和花生凝集素(PNA)等,種類繁多,各具特性,它們均是細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域研究所需的主要試劑。為了充分利用自然資源,從菠蘿蜜種子中提取凝集素,我們開展了此項(xiàng)研究。1材料和方法1.1小鼠和動(dòng)物phellus菠蘿蜜(ArtocarpusheterophellusLam.)產(chǎn)自海南島;C57純系小鼠和其他動(dòng)物均購(gòu)自江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;3T3和L929細(xì)胞株為美國(guó)ATCC公司提供。1.2其它試劑和試劑SephadexG-100和SepharoseCL-4B為Pharmacia產(chǎn)品;丙烯酰胺和BSA為Sigma產(chǎn)品;3H-TdR為中科院上海原子核所提供,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;液體閃爍計(jì)數(shù)儀為Beckman公司產(chǎn)品;培養(yǎng)板為Nunclon產(chǎn)品。1.3方法1.3.1材料預(yù)處理取菠蘿蜜種子,60℃烘干,粉碎,且過篩備用。1.3.2ss-pc-ms-u-1e-5-4e凝集素的制備按彭建宗等的方法常規(guī)PBS抽提,硫酸銨沉淀過夜(4℃),粗提物經(jīng)SephadexG-100凝膠柱過濾,獲得半純品,再經(jīng)IgA-SepharoseCL-4B親和層析柱便可獲得純的凝集素。1.3.3純度和質(zhì)量分析JL純度采用HPLC凝膠柱(Diol-300)鑒定;分子量采用SDS電泳測(cè)定,蛋白質(zhì)濃度按常規(guī)Lowry方法測(cè)定。1.3.4pb-0.5小鼠體內(nèi)小鼠紅血球的急性毒性試驗(yàn)ld50按施煒星等的方法進(jìn)行,在V型血凝板上每孔加入25μl紅血球緩沖液(0.075mol·L-1PB-0.75mol·L-1NaCl),pH7.2,每一孔中加入25μl樣品,依次作倍比稀釋,然后每孔加入25μl2%新鮮的動(dòng)物紅血球,振蕩1min,在室溫下放置1.5～2.0h,肉眼觀察結(jié)果。1.3.5細(xì)胞滲透量測(cè)定取C57小鼠胸腺,無菌常規(guī)制備胸腺細(xì)胞懸于含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中,并調(diào)整細(xì)胞濃度為5.6×106個(gè)·ml-1,在24孔板中,每孔加入懸液0.9ml和不同濃度的JL溶液0.1ml,空白對(duì)照組加入0.1ml培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)43h后,每孔加入1uCi3H-TdR,再培養(yǎng)5h后,常規(guī)膜片法收集細(xì)胞,用Beckman液閃儀測(cè)3H-TdR的滲入量(Dpm)。另外常規(guī)制備3T3和L929細(xì)胞懸液,并調(diào)定細(xì)胞濃度為5×105個(gè)·ml-1,按每孔100μl將細(xì)胞懸液加入96孔板中,同上條件培養(yǎng)24h后,按每孔100μl加入不同濃度的JL或等體積的培養(yǎng)液,培養(yǎng)12h后,每孔加入0.5uCi3H-TdR,再培養(yǎng)12h后,常規(guī)消化并收集樣品,經(jīng)液閃儀測(cè)3H-TdR滲入量(Dpm)。2結(jié)果2.1半純品jl3的純化菠蘿蜜種子經(jīng)PBS、(NH4)2SO4作用后,每克種子干粉能得22mgJL1(粗蛋白),JL1經(jīng)SephadexG-100過濾后可獲得半純品JL2,再經(jīng)IgA-SepharoseCL-4B柱親和層析,濾液超濾,凍干成粉為純化的JL3,JL3經(jīng)HPLC凝膠柱(Diol-300)檢測(cè)為單一峰(圖1),從抽提到層析柱純化為JL3,一共提純了111.28倍,血凝活力提高16.34倍(表1),同時(shí)JL3經(jīng)pH8.3的SDS檢測(cè),發(fā)現(xiàn)JL有兩個(gè)亞基,其分子量分別為12.0kDa和14.5kDa。2.2jl對(duì)高等動(dòng)物紅血球的凝集作用JL可凝集小鼠、兔、貓和人(O型)的新鮮紅血球,其中對(duì)貓的紅血球凝集作用最靈敏,對(duì)兔不靈敏;JL的純度越高,凝集作用越強(qiáng)(表2)。2.3jl對(duì)小鼠胸徑、頭高細(xì)度的增殖低濃度的JL對(duì)3H-TdR滲入C57小鼠胸腺細(xì)胞的量影響不大,而當(dāng)濃度達(dá)到20μg·ml-1時(shí),其滲入量卻隨著濃度的增大而迅速地提高,這說明JL可促進(jìn)小鼠胸腺細(xì)胞的增殖;此外我們還用人胎兒胸腺細(xì)胞作試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果相類似;另外JL對(duì)L929細(xì)胞的增殖是在低濃度時(shí)明顯,其最適濃度為5～50μg·ml-1;然而與上述兩種結(jié)果相反,JL卻使3T3細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,尤其是高濃度時(shí)更明顯。3凝集素的糖基化和血紅蛋白專一性本試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單,提取JL得率高,活力和純度也高,在一般的實(shí)驗(yàn)室均可提取。由于凝集素的血凝作用是因?yàn)槟胤肿拥囊粋€(gè)亞基與血細(xì)胞表面的凝集素專一識(shí)別的糖基結(jié)合,而另一個(gè)亞基與另外一個(gè)細(xì)胞上的糖基結(jié)合,從而通過凝集素的“搭橋”作用導(dǎo)致紅血球凝集,具有血型專一性的凝集素是該凝集素的糖結(jié)合部位識(shí)別血細(xì)胞表面血型抗原決定簇并與之結(jié)合的結(jié)果。JL血凝作用不顯示供血?jiǎng)游飳Ｒ恍?提示它所識(shí)別的糖基可能是在各種動(dòng)物細(xì)胞中都存在,而且細(xì)胞上的這類糖基可能是保守的,它們?cè)谶M(jìn)化過程中未被淘汰。但由于我們測(cè)定的血細(xì)胞種類較少,所以這只能是一種推測(cè)。JL可促進(jìn)胸腺細(xì)胞的增殖,同時(shí)低濃度的JL也可促進(jìn)L