菠蘿蜜種子中凝集素的提取及其生物學特性研究

菠蘿蜜種子中凝集素的提取及其生物學特性研究

海南島位于熱帶地區(qū)，擁有豐富的熱帶植物資源，尤其是熱帶果樹資源。凱羅蜜是著名的水果之一。它的果肉深受人們喜愛，每年的銷售額也顯著增加。然而，在食用凱羅蜜后，剩下的種子被丟棄，造成了巨大的浪費和污染。研究發(fā)現(xiàn),許多植物體內(nèi)均含有豐富的凝集素,目前已分離鑒定的凝集素有伴刀豆凝集素、麥胚凝集素(WGA)和花生凝集素(PNA)等,種類繁多,各具特性,它們均是細胞生物學等領域研究所需的主要試劑。為了充分利用自然資源,從菠蘿蜜種子中提取凝集素,我們開展了此項研究。1材料和方法1.1小鼠和動物phellus菠蘿蜜(ArtocarpusheterophellusLam.)產(chǎn)自海南島;C57純系小鼠和其他動物均購自江蘇省實驗動物中心;3T3和L929細胞株為美國ATCC公司提供。1.2其它試劑和試劑SephadexG-100和SepharoseCL-4B為Pharmacia產(chǎn)品;丙烯酰胺和BSA為Sigma產(chǎn)品;3H-TdR為中科院上海原子核所提供,其他試劑為國產(chǎn)分析純;液體閃爍計數(shù)儀為Beckman公司產(chǎn)品;培養(yǎng)板為Nunclon產(chǎn)品。1.3方法1.3.1材料預處理取菠蘿蜜種子,60℃烘干,粉碎,且過篩備用。1.3.2ss-pc-ms-u-1e-5-4e凝集素的制備按彭建宗等的方法常規(guī)PBS抽提,硫酸銨沉淀過夜(4℃),粗提物經(jīng)SephadexG-100凝膠柱過濾,獲得半純品,再經(jīng)IgA-SepharoseCL-4B親和層析柱便可獲得純的凝集素。1.3.3純度和質量分析JL純度采用HPLC凝膠柱(Diol-300)鑒定;分子量采用SDS電泳測定,蛋白質濃度按常規(guī)Lowry方法測定。1.3.4pb-0.5小鼠體內(nèi)小鼠紅血球的急性毒性試驗ld50按施煒星等的方法進行,在V型血凝板上每孔加入25μl紅血球緩沖液(0.075mol·L-1PB-0.75mol·L-1NaCl),pH7.2,每一孔中加入25μl樣品,依次作倍比稀釋,然后每孔加入25μl2%新鮮的動物紅血球,振蕩1min,在室溫下放置1.5～2.0h,肉眼觀察結果。1.3.5細胞滲透量測定取C57小鼠胸腺,無菌常規(guī)制備胸腺細胞懸于含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中,并調整細胞濃度為5.6×106個·ml-1,在24孔板中,每孔加入懸液0.9ml和不同濃度的JL溶液0.1ml,空白對照組加入0.1ml培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)43h后,每孔加入1uCi3H-TdR,再培養(yǎng)5h后,常規(guī)膜片法收集細胞,用Beckman液閃儀測3H-TdR的滲入量(Dpm)。另外常規(guī)制備3T3和L929細胞懸液,并調定細胞濃度為5×105個·ml-1,按每孔100μl將細胞懸液加入96孔板中,同上條件培養(yǎng)24h后,按每孔100μl加入不同濃度的JL或等體積的培養(yǎng)液,培養(yǎng)12h后,每孔加入0.5uCi3H-TdR,再培養(yǎng)12h后,常規(guī)消化并收集樣品,經(jīng)液閃儀測3H-TdR滲入量(Dpm)。2結果2.1半純品jl3的純化菠蘿蜜種子經(jīng)PBS、(NH4)2SO4作用后,每克種子干粉能得22mgJL1(粗蛋白),JL1經(jīng)SephadexG-100過濾后可獲得半純品JL2,再經(jīng)IgA-SepharoseCL-4B柱親和層析,濾液超濾,凍干成粉為純化的JL3,JL3經(jīng)HPLC凝膠柱(Diol-300)檢測為單一峰(圖1),從抽提到層析柱純化為JL3,一共提純了111.28倍,血凝活力提高16.34倍(表1),同時JL3經(jīng)pH8.3的SDS檢測,發(fā)現(xiàn)JL有兩個亞基,其分子量分別為12.0kDa和14.5kDa。2.2jl對高等動物紅血球的凝集作用JL可凝集小鼠、兔、貓和人(O型)的新鮮紅血球,其中對貓的紅血球凝集作用最靈敏,對兔不靈敏;JL的純度越高,凝集作用越強(表2)。2.3jl對小鼠胸徑、頭高細度的增殖低濃度的JL對3H-TdR滲入C57小鼠胸腺細胞的量影響不大,而當濃度達到20μg·ml-1時,其滲入量卻隨著濃度的增大而迅速地提高,這說明JL可促進小鼠胸腺細胞的增殖;此外我們還用人胎兒胸腺細胞作試驗,發(fā)現(xiàn)與上述結果相類似;另外JL對L929細胞的增殖是在低濃度時明顯,其最適濃度為5～50μg·ml-1;然而與上述兩種結果相反,JL卻使3T3細胞生長受到抑制,尤其是高濃度時更明顯。3凝集素的糖基化和血紅蛋白專一性本試驗方法簡單,提取JL得率高,活力和純度也高,在一般的實驗室均可提取。由于凝集素的血凝作用是因為凝集素分子的一個亞基與血細胞表面的凝集素專一識別的糖基結合,而另一個亞基與另外一個細胞上的糖基結合,從而通過凝集素的“搭橋”作用導致紅血球凝集,具有血型專一性的凝集素是該凝集素的糖結合部位識別血細胞表面血型抗原決定簇并與之結合的結果。JL血凝作用不顯示供血動物專一性,提示它所識別的糖基可能是在各種動物細胞中都存在,而且細胞上的這類糖基可能是保守的,它們在進化過程中未被淘汰。但由于我們測定的血細胞種類較少,所以這只能是一種推測。JL可促進胸腺細胞的增殖,同時低濃度的JL也可促進L