近紅外光譜一致性檢驗(yàn)技術(shù)在質(zhì)量控制中的應(yīng)用

近紅外光譜一致性檢驗(yàn)技術(shù)在質(zhì)量控制中的應(yīng)用

一致性檢驗(yàn)是一種快速的光譜比較方法。比較測(cè)量對(duì)象樣品的光譜是否與已知樣品的一組參考光譜一致，以評(píng)估測(cè)量對(duì)象樣品和已知樣品是否具有相同的藥物質(zhì)量。一致性檢驗(yàn)與一般的定性鑒別和聚類分析方法不同,它是通過(guò)控制每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度值來(lái)達(dá)到質(zhì)量控制的目的。通過(guò)一致性檢驗(yàn),待測(cè)樣品的光譜在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度都必須處于置信區(qū)間范圍內(nèi)。近紅外光譜一致性檢驗(yàn)方法最初是在1993年由W.Plugge等人提出的,用于對(duì)三水氨芐西林的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該法能夠檢測(cè)到其他建模方法所難以探查的樣品化學(xué)或物理性質(zhì)的變化,可用于控制生產(chǎn)工藝并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。之后,Gary等人對(duì)一致性檢驗(yàn)方法從準(zhǔn)確度、精密度、粗放性、一致性等各個(gè)方面進(jìn)行了考察,結(jié)果表明該法能夠滿足目前的方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)、可被現(xiàn)代嚴(yán)格的指導(dǎo)原則所接受。1i波長(zhǎng)點(diǎn)的一致性檢驗(yàn)ci其原理為,n張參考光譜在某個(gè)波數(shù)點(diǎn)處有n個(gè)吸光度值,首先計(jì)算參考光譜在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)i處吸光度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差σ。其次將每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的平均值加減多少倍(即CI限度)標(biāo)準(zhǔn)偏差σ作為該波長(zhǎng)點(diǎn)的可信區(qū)間(即容許范圍)。待測(cè)光譜在該波長(zhǎng)點(diǎn)處的吸光度與參考光譜在該波長(zhǎng)點(diǎn)處的平均值的差值除以標(biāo)準(zhǔn)偏差σ,得到的就是一致性指數(shù)(ConformityIndex:CI)。一致性檢驗(yàn)就是將待測(cè)光譜的CI與之前設(shè)定的CI限度(CIlimit)進(jìn)行比較,從而快速簡(jiǎn)單的判斷待測(cè)光譜與參考光譜是否具有一致性。檢驗(yàn)光譜在i波長(zhǎng)處的一致性指數(shù)CI值的計(jì)算公式如下:總體而言,通過(guò)對(duì)若干參考光譜在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)處的吸光度數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,為每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)設(shè)定一個(gè)容許區(qū)間,從而在全譜范圍內(nèi)形成帶狀的“河流”,這就是一致性檢驗(yàn)的模型,如圖1。待檢驗(yàn)光譜每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度都沒(méi)有超出這個(gè)帶狀范圍,便認(rèn)為待測(cè)樣品與建模所用的樣品具有一致性。2各波長(zhǎng)點(diǎn)的ci限度一致性檢驗(yàn)的閾值、也就是CI限度的設(shè)置方法一般采取統(tǒng)計(jì)學(xué)上t分布的置信水平方法,如果測(cè)定的參考光譜數(shù)量為30張,那么在不同的置信水平上對(duì)某一波長(zhǎng)點(diǎn)吸光度值應(yīng)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍數(shù)(CI限度)見表1。然而,僅僅計(jì)算某一波長(zhǎng)點(diǎn)處的概率分布得到相應(yīng)的t值、以其來(lái)設(shè)置整個(gè)譜段范圍內(nèi)的CI限度是不合理的,因?yàn)檫€要考慮整體的概率分布情況,也就是應(yīng)計(jì)算所有波長(zhǎng)點(diǎn)處在某一置信水平下均不超出CI限度的概率。因此參考文獻(xiàn)中的方法,計(jì)算了在所選譜段范圍內(nèi)各個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)處的吸光度在一定概率下均不超出的概率。在某些譜段內(nèi)所有波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度總體上達(dá)到0.9999概率下均不超限度應(yīng)設(shè)置的CI值如表2(在Excel中的計(jì)算命令是TINV((1-0.9999^(1/a)),(b-1)),其中a為波長(zhǎng)點(diǎn)數(shù),b為參考光譜數(shù)量)。3測(cè)樣次數(shù)的確定在進(jìn)行一致性檢驗(yàn)建模過(guò)程中,必須收集足夠多的代表性樣品采集其光譜圖,參考光譜的代表性是決定模型好壞的關(guān)鍵。例如針對(duì)某一批次藥品來(lái)采集光譜時(shí),盡管批次內(nèi)部的差異很小,但是仍然有一個(gè)均勻性的問(wèn)題,如果將這種藥品差異性視為隨機(jī)數(shù)據(jù),計(jì)算測(cè)定n張光譜某波長(zhǎng)點(diǎn)吸光度數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,然后重復(fù)m次計(jì)算測(cè)定n張光譜某波長(zhǎng)點(diǎn)吸光度數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的整體標(biāo)準(zhǔn)偏差,來(lái)判斷測(cè)樣中隨機(jī)數(shù)據(jù)分布的穩(wěn)定性,依此來(lái)判定代表性參考光譜所需要的數(shù)量。對(duì)此在MATLAB中進(jìn)行了計(jì)算,假設(shè)F為0~1之間n個(gè)隨機(jī)數(shù)值的矩陣,重復(fù)m次生成這個(gè)隨機(jī)數(shù)組矩陣,然后計(jì)算這m個(gè)隨機(jī)數(shù)組各自標(biāo)準(zhǔn)偏差的整體標(biāo)準(zhǔn)偏差。重復(fù)m次的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值、波動(dòng)范圍和各標(biāo)準(zhǔn)偏差的整體的標(biāo)準(zhǔn)偏差三者的分布隨著n的變化如圖2(m為1000)。從圖中可以看出,隨著測(cè)樣數(shù)量的增加,各標(biāo)準(zhǔn)偏差的波動(dòng)范圍和整體的標(biāo)準(zhǔn)偏差呈曲線下降,而且在測(cè)樣數(shù)量達(dá)到30~50之后基本趨于穩(wěn)定,因此認(rèn)為,測(cè)樣次數(shù)應(yīng)至少為30批次。如果要對(duì)某一品牌藥建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?那么需要至少30批次的樣品;如果要對(duì)某一批次的藥品建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?那么應(yīng)至少需要測(cè)定30個(gè)不同的片劑、膠囊劑或粉針劑樣品,才能具有比較穩(wěn)定的代表性。4不同儀器和條件選擇適用的檢驗(yàn)氫由于一致性檢驗(yàn)對(duì)待測(cè)光譜的要求非常苛刻,因此必須對(duì)光譜進(jìn)行一定的預(yù)處理,盡量消除各種物理和電子噪音信號(hào)的干擾。在不同儀器上測(cè)定的近紅外光譜圖,可能會(huì)因?yàn)閮x器條件的原因,導(dǎo)致對(duì)同一樣品測(cè)得的光譜會(huì)稍有差異,這種差異主要表現(xiàn)為基線的偏移和旋轉(zhuǎn)。對(duì)于基線偏移,可以通過(guò)矢量歸一化或者一階導(dǎo)數(shù)化來(lái)消除;對(duì)于基線旋轉(zhuǎn),可以采用一階導(dǎo)數(shù)化結(jié)合矢量歸一化處理來(lái)消除,或使用二階導(dǎo)數(shù)化。圖3分別為對(duì)同一批次片劑在北京和上海兩臺(tái)儀器的兩種儀器條件(不同的分辨率、樣品累計(jì)掃描次數(shù)和增益)下測(cè)得的光譜在三種不同預(yù)處理?xiàng)l件下的結(jié)果,可以看出,矢量歸一化處理后基線的旋轉(zhuǎn)沒(méi)有消除,一階導(dǎo)數(shù)化結(jié)合矢量歸一化基本消除了基線偏移和旋轉(zhuǎn)帶來(lái)的影響,只是在5000~5600和7500~6900cm-1左右的水峰譜段有一些差異,而二階導(dǎo)數(shù)化結(jié)合矢量歸一化的效果更加顯著,使得同一樣品在不同儀器上測(cè)得光譜具有很好的一致性。但是二階導(dǎo)數(shù)化容易放大噪音和散射光帶來(lái)的影響,因此平滑點(diǎn)不宜太少,以13或17為宜,也不宜太多,否則會(huì)導(dǎo)致平滑掉一些光譜信息。圖4是在同一近紅外光譜儀上采用不同條件對(duì)某一批次藥品測(cè)得的光譜圖?？梢?不同增益測(cè)得的光譜基本相似,尤其是B和C增益得到的光譜幾乎完全一致。但是Ref和A增益測(cè)得的光譜中9000cm-1以上、4500cm-1以下很容易受到噪音等干擾因素的影響,而且9000cm-1以上也基本上沒(méi)有樣品吸收信號(hào),因此不適合一致性檢驗(yàn)方法。同時(shí)也注意到,在5000~5600cm-1和6900~7500cm-1這兩個(gè)與水分吸收有關(guān)的譜段,尤其是在5000~5600波數(shù),某些制劑的光譜容易受到環(huán)境中水分含量不同帶來(lái)的影響,在不同儀器和條件下測(cè)得的光譜會(huì)有所差異。其實(shí),粉針劑的光譜是比較容易在這兩個(gè)譜段出現(xiàn)問(wèn)題的,即使同一批次粉針劑,在不同的時(shí)間測(cè)定多次,在這兩個(gè)譜段也會(huì)有所不同,而其余的譜段內(nèi)基本是非常相似的,這就說(shuō)明空氣中的水分變化對(duì)這兩個(gè)譜段的影響是比較大的,因此不適合參與建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＞C上分析,要建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?可選擇一階或二階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化預(yù)處理方法,平滑點(diǎn)數(shù)13或17個(gè),譜段為9000~7500cm-1、6900~5600cm-1和5000-4250cm-1,這三個(gè)譜段反映了CH和NH的合頻和倍頻吸收,信息量比較豐富;根據(jù)計(jì)算結(jié)果,在分辨率為4cm-1下共888個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn),如果參考光譜數(shù)量為30張,則CI限度應(yīng)設(shè)置為7。以琥乙紅霉素非鋁塑片劑為例,選取西安利君制藥有限公司2008年11月份生產(chǎn)的利君沙牌琥乙紅霉素片某一批次,采集30張光譜作為參考光譜,同時(shí)設(shè)置4個(gè)檢驗(yàn)光譜集,分別為該品牌藥2008年5月至2009年4月期間生產(chǎn)的40批次藥品的平均光譜40張、參考光譜所用樣品在19臺(tái)光譜儀上由不同人員測(cè)定的57張光譜、22個(gè)其他廠家生產(chǎn)的琥乙紅霉素片劑非鋁塑光譜22張、其他品種的大環(huán)內(nèi)酯類藥品非鋁塑光譜19張,一共138張檢驗(yàn)光譜。采用矢量歸一化預(yù)處理、全譜段建模(圖5a)與采用一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化、上述譜段建模(圖5b)兩種方式(CI限度均為7),來(lái)比較效果。由于矢量歸一化無(wú)法消除基線的旋轉(zhuǎn)帶來(lái)的一定的影響,從而導(dǎo)致參考光譜自身的一致性稍差,進(jìn)而使得標(biāo)準(zhǔn)偏差增大、光譜差異的容許度增大,所以造成了對(duì)不同廠家產(chǎn)品和不同品種藥品的許多誤判,而采用本文建議的參數(shù),能夠很好的區(qū)分該品牌藥與其他廠家產(chǎn)品以及其他同系物品種的藥品。5單次給藥后最大ci限度的確定—一致性檢驗(yàn)中其他限度控制方法介紹一致性檢驗(yàn)除了可以使用CI限度來(lái)控制、對(duì)比待分析光譜與建模參考光譜的一致性之外,還有兩種限度控制方法,分別為Sum1和Sum2值,Sum1值是待分析光譜各個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)處所有CI值超出CI限度的部分之和除以所選譜段內(nèi)的波長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)得到的數(shù)值,而Sum2值與Sum1值計(jì)算公式的分子相同,只是分母為所選譜段內(nèi)超過(guò)CI限度的波長(zhǎng)點(diǎn)的個(gè)數(shù),然后可選擇Sum1值或Sum2值來(lái)設(shè)定其限度。Sum1和Sum2值能夠在整體上容許個(gè)別的若干波長(zhǎng)點(diǎn)出現(xiàn)異常的超出CI限度的情況,適合于參考光譜采集量較少的情況,但是因?yàn)槎叩南薅却_定缺乏理論依據(jù),而且經(jīng)實(shí)際考察,對(duì)不同品種制劑所應(yīng)設(shè)置的Sum1或Sum2值限度也不相同,因此在實(shí)際中應(yīng)用很少。一致性檢驗(yàn)不僅具有定性鑒別的作用,還具有一定的定量判別的效果,例如“注射用頭孢呋辛鈉-編號(hào)22-廣州天心藥業(yè)”該批次的藥品經(jīng)過(guò)溫度80℃、濕度50%的條件下加速、并在不同時(shí)間點(diǎn)取出,測(cè)定近紅外光譜和頭孢呋辛含量值,并在一致性檢驗(yàn)中以未加速的樣品光譜作為參考光譜(圖6中兩條橫線內(nèi)的6張光譜),將不同加速時(shí)間取出的光譜作為檢驗(yàn)光譜,譜段為10000~4200cm-1,預(yù)處理方法為矢量歸一化,各參考光譜和檢驗(yàn)光譜的最大CI值分布如圖6。在使用Sum1值和Sum2值進(jìn)行計(jì)算、分析時(shí),由于Sum1值的分母太大,所以Sum1值太小,而Sum2值的分布情況如圖7。可以看出,一致性檢驗(yàn)中的最大CI值、Sum2值能夠在一定程度