中西醫(yī)結(jié)合病證大鼠模型的構(gòu)建和評價

中西醫(yī)結(jié)合病證大鼠模型的構(gòu)建和評價

現(xiàn)代中醫(yī)證候動物模型已經(jīng)研究了很多年。在回顧這個過程中，有以下重要的科學(xué)問題。首先，人類疾病可以通過某些動物模擬，但人類疾病的癥狀能否通過動物模擬？其次，臨床辯證法標(biāo)準(zhǔn)能否應(yīng)用于與人類疾病類似的動物體，以實現(xiàn)疾病動物模型的辯證。在這方面，我們需要結(jié)合疾病和癥狀，建立和評估動物模型。實驗方法和程序1動物健康雄性Wistar大鼠70只,體重(250±10)g。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。2儀器RM-6000型生理儀(日本光電株式會社),飛利浦HDI5000超聲診斷儀、CL15-7高頻線陣探頭(荷蘭),DH-140B型小動物呼吸機(浙江醫(yī)科大學(xué)實驗儀器廠生產(chǎn)),RBP-1B型鼠尾動脈血壓計(中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所研發(fā)),RM2135石蠟切片機(德國Leica產(chǎn)),BX-60熒光/透射顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品),SpotⅡSofwareV3.0顯微圖像分析系統(tǒng)(美國DiagnosticInstruments公司產(chǎn)品),BRAUNIRT3520紅外線體溫計(德國博朗公司產(chǎn)品)。3大鼠心肌梗死模型制作將大鼠隨機分為兩組,模型組大鼠經(jīng)麻醉、開胸、呼吸機正壓呼吸,在動脈圓錐與左心耳之間下約1mm處結(jié)扎左冠狀動脈。當(dāng)心電圖Ⅰ導(dǎo)聯(lián)顯示ST段顯著抬高后,重置心臟于胸腔,分層縫合胸壁。觀察動物心律、呼吸至平穩(wěn)。假手術(shù)組大鼠手術(shù)過程同上,但不結(jié)扎左冠狀動脈。術(shù)后兩組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)8周,于術(shù)后第9周開始模型組大鼠以左旋硝基精氨酸(L-NAME)每天100mg/kg灌胃(1mL/100g體重)4周。假手術(shù)組大鼠灌胃同體積生理鹽水。4心肌梗死模型的心力衰竭疾病診斷造模大鼠術(shù)后4周和12周后,經(jīng)阻抗法測定心功能,即每搏量(SV)、每分鐘心輸出量(CO)和心臟指數(shù)(CI),當(dāng)CI值≤180mL/(min·kg)為心力衰竭動物模型成功。術(shù)后8周進行超聲心動圖檢查,用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,仰臥位固定,大鼠左胸前備皮后,選取標(biāo)準(zhǔn)左室乳頭肌短軸切面和左室長軸切面,結(jié)合M型和多普勒超聲進行檢查(CL15-7高頻線陣探頭、7-15MHz)。每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值,超聲檢查的操作采用單盲法。血壓測定:在大鼠清醒狀態(tài)下采用鼠尾動脈血壓測量法測量。5動物模型的中醫(yī)證候診斷術(shù)后12周連續(xù)觀察大鼠和采集四診信息進行八綱辨證,然后進行聯(lián)系臟腑的氣血辨證。所有辨證標(biāo)準(zhǔn)均采用臨床的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn);對于四診指標(biāo)中的問診內(nèi)容,將其問診的生物學(xué)內(nèi)容替代具有同等意義的實驗計量指標(biāo)。5.1八綱辨證一般狀況觀察:活動量、毛發(fā)、精神狀況、體重指數(shù)、飼料消耗指數(shù)等進行表里、寒熱、虛實、陰陽的八綱辨證,確定動物模型的中醫(yī)基本性質(zhì)。根據(jù)虛證辨證標(biāo)準(zhǔn),將診斷心虛證、氣虛證必備的心悸或胸悶、神疲乏力分別以心率、力竭游泳時間測定表示,參考標(biāo)準(zhǔn)以血流動力學(xué)指標(biāo)表示。5.2心陽虛證的診斷在氣虛證候加重的前提下,具備某些陽虛證候的特異性表現(xiàn),如全身或局部畏寒或肢冷、夜尿頻多,分別以大鼠體溫和尿量表示。(1)心率測定:大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射,經(jīng)心電圖測得心率。(2)力竭游泳時間測定:水池深35cm、面積0.8m、池壁光滑、水溫(31±1)℃,大鼠游泳中頭下沉沒于水面10s為力竭游泳時間標(biāo)志。(3)尿量測定:大鼠早晨統(tǒng)一灌胃5mL水后,置代謝籠中收集12h(早晨8:00～晚上8:00)尿液,實驗期間禁飲水。(4)體溫測量:在室溫(25±2)℃動物室中,每日上午10:00用紅外線體溫計測量大鼠耳溫3次,記錄均值。5.3血瘀證標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)進行心電圖、臟體比值和左心室腔面積測定。(1)左心室腔面積測定:大鼠心臟石蠟切片行HE染色,經(jīng)顯微圖像分析法測出。(2)心肌細(xì)胞凋亡測定:采用原位細(xì)胞凋亡免疫組化法進行,試劑盒為德國BoehringerMannheim公司產(chǎn)品。(3)單位面積內(nèi)心肌膠原含量測定:大鼠心臟石蠟切片行Masson染色,每張圖片隨機選取面積固定的5個視野,應(yīng)用SpotⅡ結(jié)果為單位面積內(nèi)膠原陽性染色面積(mm)顯微圖像分析系統(tǒng)自動測量。6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.5軟件,采用單因素方差分析及成組t檢驗;如果未通過方差齊性檢驗,則采用單因素方差分析及方差不齊的成組t檢驗,兩組比較采用t檢驗。血壓動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)1大鼠造模一般狀況觀察首批造模大鼠30只在4周中存活了25只,模型組大鼠多表現(xiàn)為活動少,精神萎靡、蜷縮,毛發(fā)枯槁、呈黃白色、多見倒豎,反抗較輕、少撕咬;假手術(shù)組大鼠活潑,毛發(fā)呈白色而光澤,反抗劇烈、撕咬。2兩組大鼠術(shù)后不同時間心率、力竭游泳時間、體溫和尿量比較(表1)心率:造模大鼠術(shù)后3個時間段心率明顯比同時期假手術(shù)組加快(P<0.01),且術(shù)后早期模型大鼠多伴有心律不齊。力竭游泳時間:各時間段模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠力竭游泳時間明顯縮短(P<0.01)。體溫:模型組大鼠體溫在術(shù)后各時間段多在36～37℃,比同期假手術(shù)組低,但差異未見有統(tǒng)計學(xué)意義。尿量:模型組大鼠尿量在術(shù)后各時間段比假手術(shù)組增多(P<0.05或P<0.01)3兩組大鼠血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)結(jié)果(表2)模型組大鼠SV、CO、CI測定值術(shù)后3個時間段比同期假手術(shù)組降低(P<0.05或P<0.01),SBP12周時升高(P<0.05)。4模型大鼠血瘀證候的觀察4.1兩組大鼠術(shù)后不同時間心電圖12導(dǎo)聯(lián)比較模型組大鼠ST段升高數(shù)量明顯多于同期假手術(shù)組,即10天模型組大鼠ST段升高數(shù)量13個和假手術(shù)組ST段升高數(shù)量5個(下同),4周時為6個和1個,8周時為11個和0個;模型組大鼠異常Q波數(shù)量明顯多于同期假手術(shù)組,即10天時為29個和0個,4周時為25個與4個,8周時為1個和0。4.2兩組大鼠臟體比值和單位面積內(nèi)心肌膠原含量變化結(jié)果(表3)臟體比值:模型組大鼠臟體比值大于假手術(shù)組(P<0.01)。單位面積內(nèi)膠原含量:模型組大鼠心室肌在術(shù)后不同時間單位面積內(nèi)心肌膠原含量持續(xù)增高,并較同期假手術(shù)組增多(P<0.01)。4.3兩組大鼠左室腔面積的變化術(shù)后第10天時模型組大鼠左室腔面積為(11.49±2.65)mm,術(shù)后4周和8周時模型組左室腔面積為(13.67±2.55)mm和(14.92±2.36)m,均比同期假手術(shù)組[(4.72±0.66)mm2、(6.11±0.69)mm、(7.05±1.01)mm]為大(P<0.01)。4.4兩組大鼠術(shù)后8周超聲心動圖測定結(jié)果模型組大鼠(n=9)室間隔舒張期厚度和左室后壁舒張期厚度分別為(0.70±0.14)mm和(1.59±0.43)mm,均較假手術(shù)組(n=9)的[(2.12±0.29)mm和(2.37±0.36)mm]變薄(P<0.01);且模型組大鼠左室舒張期和收縮期內(nèi)徑明顯增大(P<0.01)。模型組左室射血分?jǐn)?shù)[(34.07±7.26)%]低于假手術(shù)組[(92.26±3.44)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5兩組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果(表3)模型組大鼠術(shù)后4個時間段梗塞邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡陽性率均高于假手術(shù)組(P<0.01)。中醫(yī)證候?qū)W研究的意義本研究的心氣虛、心陽虛血瘀病證模型是移植心肌梗死致心力衰竭大鼠的現(xiàn)代實驗醫(yī)學(xué)成熟的制作模型,而后運用中醫(yī)八綱辨證和虛證、血瘀證的全國統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)對疾病模型進行辨證;將其定性的問診內(nèi)容替代以同等意義的定量測試指標(biāo)進行評價。在本研究中模型大鼠表現(xiàn)精神萎靡、少活動、皮毛枯槁、倒豎、反抗輕,少撕咬皆為陰證、虛證,可明顯與活躍、亢奮、激惹的陽證和陰虛陽亢證候相鑒別。中國中西醫(yī)結(jié)合會1986年修訂的虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定心氣虛證診斷的必備條件是心悸或胸悶、神疲乏力,我們分別以心率、力竭游泳時間的定量指標(biāo)測定來取證;對于標(biāo)準(zhǔn)中的血流動力學(xué)障礙等參考標(biāo)準(zhǔn)我們則以心肌阻抗法和超聲心動儀所測得心功能來表示,力求完善中醫(yī)心氣虛證的診斷。本研究中陽虛證候的制作是在心力衰竭氣虛模型的基礎(chǔ)上,給予大鼠一氧化氮合酶抑制劑——左旋硝基精氨酸,使其血壓升高、心功能惡化致心衰發(fā)展,氣虛證候加重,并出現(xiàn)體溫低、尿量增加等陽虛證候的特有表現(xiàn)。這一研究思路是將中西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究中規(guī)范、成熟、統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)引入中醫(yī)動物模型的研究,是從已知去探求未知。因為臨床中疾病與證候是同存于非健康的生命體,實驗建立的反映軀體類疾病的動物模型能夠帶有被研究者識別的中醫(yī)證候表現(xiàn)。同時本研究還參考了臨床心肌梗死患者的中醫(yī)證候變化規(guī)律,即多氣虛、陽虛、多血瘀,注重從中醫(yī)臨床吸取經(jīng)驗和取得的研究成果,并以此指導(dǎo)中醫(yī)基礎(chǔ)研究。中醫(yī)動物模型及模型評價體系是中醫(yī)藥現(xiàn)代化系統(tǒng)過程中具有承上啟下重要作用的環(huán)節(jié),是屬于中醫(yī)