殼聚糖改性聚乳酸細(xì)胞微球的制備及性能研究

殼聚糖改性聚乳酸細(xì)胞微球的制備及性能研究

生物降解細(xì)胞微載體的特殊形狀，不僅可以作為細(xì)胞的高密度培養(yǎng)微載體，而且可以作為組織工程中可執(zhí)行的細(xì)胞載體，修復(fù)和再生組織和器官缺陷，并作為微標(biāo)簽。聚乳液酸（pla）和硫酸-羥基苯甲酸共聚物（plga）的微球具有良好的生物降解性，用于培養(yǎng)肌腱和細(xì)胞。然而，這種聚合物表面的薄水性和生物多樣性不利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。殼聚糖是一種天然的生物顆粒，具有良好的生物降解性和細(xì)胞適應(yīng)性，可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。因此，將殼聚糖固定到聚乳液微球表面，可以有效提高聚合物表面的細(xì)胞相容性。在這項(xiàng)工作中，我們使用傳統(tǒng)的乳化溶劑法制備聚乳液微球，并使用氨化法將氨基酸引入聚乳液表面。用聚液甘酸涂層將聚液細(xì)胞微載體結(jié)合起來(lái)，研究軟骨細(xì)胞的變化后聚液微液表面的生長(zhǎng)行為。1實(shí)驗(yàn)方法1.1聚乳酸微球的制備采用傳統(tǒng)的乳化溶劑揮發(fā)法制備聚乳酸微球,過(guò)篩,收集粒徑范圍在180～280μm的聚乳酸微球備用.采用氨解和接枝涂層法將殼聚糖固定在聚乳酸微球表面.將聚乳酸微球浸入到6%己二胺/正丙醇溶液中.在60℃水浴中反應(yīng)一定時(shí)間后,棄去己二胺溶液,并用去離子水洗滌數(shù)次以除去殘余的己二胺,獲得表面含有自由氨基的聚乳酸微球.將氨基化聚乳酸微球浸泡于1%的戊二醛溶液中,常溫下3h后,取出并用去離子水洗滌數(shù)次后獲得表面含有自由醛基的聚乳酸微球.將醛基化聚乳酸微球浸入1%殼聚糖的3%乙酸溶液中,4℃下24h后,將微球取出,先用0.5mol/LNaOH溶液洗滌數(shù)次,再用去離子水洗滌數(shù)次后,置于真空35℃下干燥3d,得到聚乳酸微球樣品.1.2材料表面形態(tài)和mtt活性的檢測(cè)分別采用茚三酮法和乙酰丙酮-對(duì)二甲氨基苯甲醛法用CARY100BIO紫外分光光度計(jì)測(cè)定聚乳酸微球表面的氨基含量和殼聚糖含量.在掃描電子顯微鏡(JOL5000)下觀察PLA微球的不同表面形態(tài)的變化.在二甲基二氯硅烷處理后的25mL培養(yǎng)瓶中,按照文獻(xiàn)的方法在改性前后的PLA微球表面進(jìn)行軟骨細(xì)胞培養(yǎng),以考察材料表面的細(xì)胞相容性.使用Bio-Rad500酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,Sigma)活性.在Bio-RadRadiance2100型激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和分布,采用熒光素二乙酸酯(FDA)將活細(xì)胞染色.2結(jié)果與討論2.1氨解時(shí)間對(duì)微球表面的影響采用氨解方法將氨基引入到PLA表面,其原理是己二胺中的一個(gè)氨基與PLA主鏈上的酯基發(fā)生酯交換反應(yīng),在將高分子部分?jǐn)噫湹耐瑫r(shí),將另外一個(gè)氨基引入到材料表面.由于氨解本質(zhì)上也是一種降解反應(yīng),降解產(chǎn)生的低分子量的聚合物鏈會(huì)從微球表面脫落,造成微球的質(zhì)量損失.其質(zhì)量損失率隨著氨解時(shí)間的延長(zhǎng),呈近線性增長(zhǎng),8min后將近5%.質(zhì)量損失到一定程度會(huì)造成機(jī)械強(qiáng)度的下降,因此在保證所需引入氨基含量的前提下氨解時(shí)間應(yīng)盡量短.圖1表明,微球表面的氨基含量隨著氨解時(shí)間的延長(zhǎng)先增大,到一定值后則基本保持不變,與前人的工作結(jié)果相符.其主要原因是氨解反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由氨基隨聚合物鏈脫落,也可能同時(shí)包括自由氨基和聚合物鏈端羧基反應(yīng)所導(dǎo)致的氨基減少.初期氨基的生成量大于損失量,到一定時(shí)間后兩者作用相當(dāng).用乳化溶劑揮發(fā)法制備的聚乳酸微球,外觀均為球體,其表面粗糙且有一些較大的孔洞(圖2a).這些孔洞可能是制備過(guò)程中的剪切力造成的.比較圖2b和圖2c,氨解8min后微球表面出現(xiàn)大量針狀的細(xì)紋,表面變得更加粗糙,而且出現(xiàn)一些較大的裂紋.這與氨解導(dǎo)致的質(zhì)量損失是一致的,也說(shuō)明在較短的氨解時(shí)間內(nèi)就能夠提供足夠多的活性位點(diǎn)用于殼聚糖的接枝涂層.2.2化學(xué)接枝殼聚糖殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)中含有大量的氨基.聚乳酸微球表面的自由氨基與醛基發(fā)生縮合反應(yīng),在過(guò)量的戊二醛溶液中微球的氨基表面被轉(zhuǎn)換成自由醛基表面.殼聚糖上的氨基可以與聚乳酸微球表面的醛基發(fā)生縮合從而將殼聚糖分子鏈接枝到聚乳酸微球表面.這種化學(xué)接枝殼聚糖的方法有利于殼聚糖溶液在微球表面的鋪展和涂層.進(jìn)一步利用殼聚糖在酸性下溶解,堿性下沉淀的特點(diǎn),用堿性溶液洗滌微球就可以在化學(xué)接枝殼聚糖表面的同時(shí),增加一層物理涂層.該接枝涂層法比接枝或物理涂層法引入的殼聚糖量多,且穩(wěn)定性好.采用乙酰丙酮-對(duì)二甲氨基苯甲醛法定量測(cè)定氨解時(shí)間為8min的聚乳酸微球(PLA-NH2,氨基含量2.94×10-7mol/mg)表面接枝涂層的殼聚糖含量為3.34μg/mg(PLA-g-Chit).接枝涂層殼聚糖的微球表面比氨解微球表面更為光滑平整,氨解產(chǎn)生的針狀細(xì)紋明顯消失(圖2c,2d).顯然,這是殼聚糖在氨解微球表面的涂層使粗糙的表面變得光滑,且涂層將針狀細(xì)紋覆蓋.2.3mtt細(xì)胞活性和細(xì)胞活性對(duì)mtt活性的影響由圖3可見(jiàn),軟骨細(xì)胞在PLA-g-Chit表面的粘附數(shù)和7d時(shí)的增殖數(shù)明顯高于空白聚乳酸微球.在圖4a中,軟骨細(xì)胞分布不均勻,大部分微球上面只有零星的細(xì)胞生長(zhǎng);而圖4b中,軟骨細(xì)胞分布均勻,在單個(gè)微球上形成一個(gè)細(xì)胞層.同時(shí),生長(zhǎng)在PLA-g-Chit表面的軟骨細(xì)胞MTT活性(0.191)也高于空白聚乳酸微球(0.147),這與細(xì)胞數(shù)量是一致的.圖3和圖4以及細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氨解-接枝涂層法將殼聚糖固定在聚乳酸微球表面,有利于細(xì)胞在微球表面的粘附和生長(zhǎng),提高聚乳酸微球表面的細(xì)胞相容性.殼聚糖是甲殼素脫乙酰化產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)成分糖胺聚糖(GAGs)相似.它具有良好的生物相容性和適當(dāng)?shù)慕到庑阅?在正常條件下植入體內(nèi)的殼聚糖基生物材料不會(huì)引起炎癥或過(guò)敏反應(yīng),其生物降解產(chǎn)物(葡胺糖)可進(jìn)入糖胺聚糖和糖蛋白代謝途徑.同時(shí),殼聚糖還是一種生物活性物質(zhì),能刺激宿主抵御病毒和細(xì)菌感染的免疫系統(tǒng),并能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合以及軟組織或硬組織的修復(fù)和再生.并且,聚乳酸和殼聚糖二者均為生物降解材料,其降解產(chǎn)物均可通過(guò)機(jī)體的正常代謝途徑被排除體外.將一定比例的微球與較大粘度的液體(如甘油)混合,可使其自由流動(dòng)并進(jìn)行注射.3丙醇對(duì)殼聚糖的吸附以聚乳酸微球?yàn)榛?采用氨解和接枝涂層相結(jié)合的方法能夠制備殼聚糖表面改性的聚乳酸細(xì)胞微載體.隨著在1,6-己二胺/正丙醇溶液中氨解時(shí)間的增加,引入的自由氨基含量先增加,后幾乎保持不變,自由氨基