不同品種葉用泡菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生的研究

不同品種葉用泡菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生的研究

葉子采用韭菜brysicvar.follosa，是十字花科的一種叢生草本植物。它營(yíng)養(yǎng)豐富，適合新鮮食品和加工。它深受人們喜愛(ài)。這是中國(guó)最常見(jiàn)的泡菜。目前,生產(chǎn)上葉用芥菜仍以常規(guī)品種為主［1］,傳統(tǒng)育種獲得純系及性狀穩(wěn)定后代需要多代自交和后代性狀選擇,所需年限較長(zhǎng)［2］。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得純合系,從而縮短雜交育種年限,提高選擇效力,加快優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移是當(dāng)前葉用芥菜育種的重要技術(shù)方法和理想途徑,目前已在甘藍(lán)型油菜Brassicanapus,白菜Brassicacampestrisssp.chinensis,青花菜Brassicaoleraceavar.italica,甘藍(lán)Brassicaoleracea等蕓薹屬蔬菜作物育種中得到廣泛應(yīng)用［3-7］。與蕓薹屬其他蔬菜相比,芥菜種Brassicajuncea蔬菜游離小孢子培養(yǎng)建立困難,相關(guān)研究報(bào)道不多。目前,在葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)技術(shù)體系方面,也僅在金絲芥Bras-sicajunceavar.multisecta,雪里蕻Brassicajunceavar.multiceps,結(jié)球芥Brassicajunceavar.capitata、獨(dú)山大葉青Brassicajunceavar.rugosa等部分品種上有少量研究報(bào)道［8-13］。小孢子誘導(dǎo)分化困難、成胚率低,仍然是當(dāng)前葉用芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系建立的主要問(wèn)題。本試驗(yàn)以5個(gè)不同葉用芥菜品種為材料,研究了不同遺傳背景、低溫預(yù)處理、高溫?zé)釗?、培養(yǎng)基更新及加液、秋水仙堿處理對(duì)小孢子胚狀體發(fā)生及發(fā)育的影響,以期為葉用芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的有效利用提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料的確定以‘四季客家芥’‘上海金絲芥’‘溫州芥菜’‘特選九心芥’‘花葉香芥菜’等5個(gè)葉用芥菜品種為試驗(yàn)材料。2010年和2011年秋季播種,塑料大棚內(nèi)越冬后于第2年春季3-4月花期進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。1.2小芽孢桿菌回復(fù)突變體lg的染色臨近開(kāi)花時(shí),選取長(zhǎng)度10cm左右的主花序或頂部一級(jí)分枝花序于4℃保濕放置1~3d,醋酸洋紅染色后鏡檢觀測(cè)小孢子發(fā)育時(shí)期,選取單核晚期小孢子所占比例較大的花蕾(直徑2~3mm),先用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡30s,再用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞(HgCl2)處理10min,無(wú)菌水沖洗5次。1.3小組分液parafilm培養(yǎng)組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的蔗糖B5液體培養(yǎng)基(含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分,pH5.8,高溫滅菌)為小孢子收集培養(yǎng)基;以不同蔗糖質(zhì)量濃度NLN培養(yǎng)基為小孢子培養(yǎng)液(含NLN大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分,蔗糖質(zhì)量濃度為90.0~170.0g·L-1,pH5.8,過(guò)濾滅菌)。表面滅菌后的花蕾放入無(wú)菌試管中·皿-1(加約3mLB5培養(yǎng)基),用無(wú)菌玻璃棒擠壓花蕾散出小孢子,經(jīng)38μm濾網(wǎng)過(guò)濾,收集濾液至10mL離心管,600r·min－1離心3min,棄上清,加入B5培養(yǎng)基重新懸浮小孢子,離心重復(fù)3次。最后加入小孢子培養(yǎng)液,用血球計(jì)數(shù)器調(diào)整小孢子濃度為1×108個(gè)·L－1,分裝至60mm×15mm培養(yǎng)皿,3mL·皿-1,Parafilm膜封口,33℃高溫?zé)峒ぬ幚?4h后,轉(zhuǎn)入25℃靜置暗培養(yǎng),待肉眼可見(jiàn)白色胚狀體后,轉(zhuǎn)至50r·min－1的搖床震蕩培養(yǎng)。接種30d后統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)量及子葉胚比例(將胚狀體分為子葉形胚和其他類型2種),用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著差異性分析。1.4小菌株的發(fā)育、細(xì)胞學(xué)和形態(tài)的觀察小孢子培養(yǎng)期間,用Nikon倒置顯微鏡(TS100-F)觀察小孢子細(xì)胞發(fā)育及形態(tài)變化,并拍照記錄。1.5以供試根的程序規(guī)定,有“生長(zhǎng)芽”或“生根培養(yǎng)基”生長(zhǎng)將子葉胚在光下培養(yǎng)轉(zhuǎn)綠后接種于B5+0.5mg·L－16-卞基氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg·L－1萘乙酸(NAA)胚分化培養(yǎng)基上,萌發(fā)出芽后再轉(zhuǎn)入B5+0.2mg·L－1NAA生根培養(yǎng)基上,生根形成完整植株;分化及生根培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量濃度均為30.0g·L-1,瓊脂7.0g·L-1,pH5.8,高溫滅菌。1.6材料的添加方式1.6.1低溫預(yù)處理的影響供試材料花序保濕條件下,4℃低溫預(yù)處理24,48,72h后分別進(jìn)行小孢子游離培養(yǎng),以不進(jìn)行低溫預(yù)處理為對(duì)照。1.6.2高溫?zé)峒ぬ幚淼挠绊懝┰嚥牧戏蛛x出的游離小孢子在33,34,35℃靜置暗培養(yǎng)條件下分別進(jìn)行24,48,72h熱激處理,然后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)培養(yǎng),以25℃恒溫培養(yǎng)作對(duì)照。1.6.3更新及添加培養(yǎng)基的影響剛分離的小孢子在不同蔗糖質(zhì)量濃度NLN培養(yǎng)基中33℃熱激培養(yǎng)48h后,經(jīng)過(guò)更換或添加等量培養(yǎng)基等不同處理后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)培養(yǎng),以NLN-13培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)為對(duì)照。其中NLN-9,NLN-13,NLN-17培養(yǎng)基均以NLN培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,蔗糖質(zhì)量濃度分別為90.0g·L-1,130.0g·L-1和170.0g·L-1。1.6.4秋水仙堿的影響將質(zhì)量濃度分別為1.0,10.0,50.0,100.0mg·L－1的秋水仙堿添加至NLN-13小孢子培養(yǎng)基中,懸浮剛分離純化的小孢子培養(yǎng)24~48h后,轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的NLN-13培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),以不含秋水仙堿培養(yǎng)基培養(yǎng)作對(duì)照。以上各因素試驗(yàn)每個(gè)處理培養(yǎng)30個(gè)花蕾的小孢子,重復(fù)3次,30d后觀察胚狀體發(fā)生情況,統(tǒng)計(jì)胚狀體總數(shù)及子葉胚數(shù)量。2結(jié)果與分析2.1轉(zhuǎn)綠菌株的獲得和分離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),剛游離的小孢子(圖1-Ⅰ)經(jīng)高溫?zé)峒ぬ幚砗蟛糠中℃咦酉仁求w積膨大(圖1-Ⅱ),之后少數(shù)膨大小孢子發(fā)生1次細(xì)胞分裂(圖1-Ⅲ),后經(jīng)多次細(xì)胞分裂(圖1-Ⅳ),繼續(xù)發(fā)育形成球形胚,心型胚(圖1-Ⅴ)和魚(yú)雷型胚(圖1-Ⅵ)等,將光照條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)綠的子葉型胚(圖1-Ⅶ,1-Ⅷ)轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基進(jìn)行胚萌發(fā)、分化、生根后獲得再生植株(圖1-Ⅸ)。2.2料間胚狀體產(chǎn)量由表1可知:供試品種游離小孢子經(jīng)33℃高溫處理24h,有‘上海金絲芥’‘特選九心芥’‘花葉香芥菜’3個(gè)品種產(chǎn)生胚狀體。不同基因型材料間胚狀體產(chǎn)量差異顯著,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胚數(shù)量多的材料,子葉胚所占比例也相應(yīng)較高?！剡x九心芥’出胚總數(shù)最多,平均產(chǎn)胚2.20個(gè)·蕾－1,子葉胚比例也高達(dá)50.0%;‘花葉香芥菜’獲得胚狀體數(shù)量最少,平均產(chǎn)胚0.22個(gè)·蕾－1,子葉胚比例僅為34.7%;而‘四季客家芥’‘溫州芥菜’未能誘導(dǎo)出胚,經(jīng)33℃熱激培養(yǎng)4h后,顯微鏡下觀察到上述兩品種有少量小孢子膨大現(xiàn)象,但之后未見(jiàn)有進(jìn)一步的細(xì)胞分裂。2.3‘特選九心瞳’對(duì)第2448h的影響從表2可以看出:低溫處理24~48h條件下供試材料產(chǎn)胚數(shù)量較高?！虾＝鸾z芥’最佳低溫預(yù)處理時(shí)間為48h,平均出胚0.88個(gè)·蕾－1,為對(duì)照的1.5倍;‘特選九心芥’經(jīng)24~48h低溫預(yù)處理胚狀體發(fā)生能力明顯提高,但隨著時(shí)間延長(zhǎng)至72h,出胚數(shù)由2.57個(gè)·蕾－1減少至1.59個(gè)·蕾－1,產(chǎn)胚能力明顯下降;與對(duì)照相比,‘花葉香芥菜’低溫預(yù)處理胚狀體數(shù)量差異不明顯。2.4熱激處理對(duì)小芽孢桿菌產(chǎn)胚的影響由表3可知:不同熱激處理溫度和時(shí)間,供試材料小孢子產(chǎn)胚量差異顯著。33~34℃高溫?zé)峒ぬ幚砟茱@著提高大部分材料胚狀體發(fā)生頻率,35℃處理的胚狀體的發(fā)生數(shù)量則明顯減少。此外,高溫?zé)峒ぬ幚頃r(shí)間亦對(duì)小孢子產(chǎn)胚量有一定影響,33~34℃條件下處理24~48h小孢子胚狀體誘導(dǎo)率較高;‘特選九心芥’在33℃熱激處理48h條件下出胚量最高,平均產(chǎn)胚2.71個(gè)·蕾－1,隨著熱激處理時(shí)間延長(zhǎng)至72h,產(chǎn)胚量明顯下降;‘上海金絲芥’則以34℃處理24h最佳,‘花葉香芥菜’以34℃處理48h效果最佳。對(duì)照處理5個(gè)基因型材料則均未誘導(dǎo)出胚狀體。2.5采用蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的“上海金設(shè)立”培養(yǎng)模式從表4可以看出:在6個(gè)處理中,質(zhì)量濃度為17%的蔗糖起始培養(yǎng)后添加等量的90.0g·L-1蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好。該處理能顯著提高‘上海金絲芥’‘特選九心芥’‘花葉香芥菜’胚狀體發(fā)生頻率;170.0g·L-1蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,重新離心更換130.0g·L-1蔗糖培養(yǎng)基亦能顯著提高‘上海金絲芥’‘花葉香芥菜’產(chǎn)胚能力;而170.0g·L-1蔗糖持續(xù)培養(yǎng)則嚴(yán)重抑制小孢子胚狀體發(fā)育,所有供試材料均無(wú)法獲得胚狀體。130.0g·L-1蔗糖起始培養(yǎng)后更新或加液等處理對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響則因材料不同而效果不盡相同。2.6秋水仙堿對(duì)出胚量的影響由表5結(jié)果可以看出:適宜的秋水仙堿質(zhì)量濃度及其時(shí)間處理能夠有效促進(jìn)小孢子胚胎發(fā)生。試驗(yàn)中,1.0~10.0mg·L－1低質(zhì)量濃度秋水仙堿處理能顯著提高大部分材料產(chǎn)胚量,隨著質(zhì)量濃度提高,100.0mg·L－1秋水仙堿處理則明顯抑制胚狀體的產(chǎn)生。1.0mg·L－1秋水仙堿處理24~48h,能顯著提高‘特選九心芥’出胚量,最高達(dá)3.16個(gè)·蕾－1;10.0mg·L－1秋水仙堿處理24~48h,則顯著提高‘花葉香芥菜’胚產(chǎn)量;10.0mg·L－1秋水仙堿處理48h比24h不僅顯著增加胚產(chǎn)量,子葉胚比例亦提高5.7%?！虾＝鸾z芥’最佳處理?xiàng)l件為50.0mg·L－1處理24h,出胚量最高達(dá)1.68個(gè)·蕾－1,處理時(shí)間延長(zhǎng)為48h,出胚量則迅速降低僅為0.99個(gè)·蕾－1?？梢?jiàn)較低質(zhì)量濃度秋水仙堿及適宜時(shí)間組合有助于促進(jìn)胚狀體產(chǎn)生,高質(zhì)量濃度秋水仙堿及長(zhǎng)時(shí)間處理則會(huì)造成毒害。3熱激對(duì)葉用采后小芽孢桿菌胚狀體誘導(dǎo)的作用材料的遺傳背景對(duì)小孢子胚狀體發(fā)生有較大影響,相同條件下,不同基因型材料小孢子培養(yǎng)效果存在顯著差異。劉冬等［8］利用7種基因型芥菜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)試驗(yàn),6種基因型獲得了小孢子胚,3種基因型得到了再生植株;本試驗(yàn)以5個(gè)葉用芥菜品種為材料,最終有4個(gè)基因型材料成功誘導(dǎo)胚狀體,胚產(chǎn)量最高為3.16個(gè)·蕾－1,而有的材料未能出胚或產(chǎn)量較低,供試基因型之間小孢子胚狀體發(fā)生能力差異很大,這與前人結(jié)論一致。適宜的溫度和時(shí)間處理可以改善小孢子代謝,利于小孢子適應(yīng)離體后培養(yǎng)環(huán)境,促進(jìn)其正常生長(zhǎng)。王亦菲等［14］研究表明:4℃低溫預(yù)處理油菜1~2d有利于提高胚胎發(fā)生。但耿建峰等［7］報(bào)道接種前低溫預(yù)處理花蕾對(duì)白菜小孢子胚誘導(dǎo)率影響差異不大,超過(guò)5d反而下降。本試驗(yàn)中不同基因型葉用芥菜對(duì)低溫預(yù)處理反應(yīng)不同,有些品種低溫預(yù)處理24~48h能顯著提高胚狀體的產(chǎn)量,有些則與對(duì)照無(wú)明顯差異,因而,實(shí)踐應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體材料做相應(yīng)探索與研究。高溫?zé)峒?duì)于啟動(dòng)小孢子分裂和改變小孢子定向發(fā)育具有重要作用,廣泛應(yīng)用于蕓薹屬作物花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)。劉冬等［8］報(bào)道對(duì)芥菜小孢子采用25,30,33,35℃熱激處理3d,只有33℃處理出胚。本試驗(yàn)表明33~34℃高溫?zé)峒ぬ幚砣~用芥菜小孢子24~48h對(duì)胚狀體誘導(dǎo)效果較好,72h培養(yǎng)明顯降低胚狀體的發(fā)生頻率。蔗糖是小孢子培養(yǎng)過(guò)程中主要碳源和滲透壓調(diào)節(jié)劑,糖質(zhì)量濃度對(duì)維持小孢子活力及胚狀體的發(fā)生有重要影響。采用更新或加液培養(yǎng)能顯著提高胚產(chǎn)量,在蕓薹屬其他作物游離小孢子培養(yǎng)中已有報(bào)道［15-17］。本試驗(yàn)采用質(zhì)量濃度為170.0g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后添加等量的90.0g·L-1蔗糖培養(yǎng)基,使終質(zhì)量濃度為130.0g·L-1,顯著提高了葉用芥菜小孢子產(chǎn)胚數(shù)量。試驗(yàn)中,添加培養(yǎng)基處理胚狀體誘導(dǎo)率顯著好于培養(yǎng)基更新處理,可能與低質(zhì)量濃度蔗糖培養(yǎng)基等量添加既可以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、降低培養(yǎng)液中不利代謝產(chǎn)物濃度,又可以避免培養(yǎng)基更新時(shí)重新離心對(duì)小孢子造成的傷害有關(guān)。秋水仙堿直接處理游離小孢子提高出胚率及成苗率,在油菜等小孢子培養(yǎng)中有較多應(yīng)用［17-19］,但秋水仙堿對(duì)葉用芥菜的影響,目前,還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明:較低質(zhì)量濃度秋水仙堿處理可以顯著提高4個(gè)品種胚狀體產(chǎn)量;對(duì)于難出胚品種‘溫州芥菜’,適宜質(zhì)量濃度的秋水仙堿處理后明顯促進(jìn)胚狀體發(fā)生。本試驗(yàn)在比較遺傳背景、低溫預(yù)處理、高溫?zé)釗舻纫蛩貙?duì)