遠(yuǎn)緣嫁接植物的遺傳特性分析

遠(yuǎn)緣嫁接植物的遺傳特性分析

試管育種也稱為微遺傳，是一種在試管中通過嫁接砧木和砧木獲得新植物的技術(shù)。在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在人類控制的環(huán)境條件下，移植植物的種植，消除了外部環(huán)境因素對(duì)移植生存的影響，并被廣泛應(yīng)用于許多植物的研究和生產(chǎn)中。遠(yuǎn)緣嫁接是不同屬不同種甚至是不同科的植物間進(jìn)行嫁接,如嫁接成功,不僅能夠提高觀賞價(jià)值,提高產(chǎn)量和改進(jìn)品質(zhì),還能培育出新品種。由于遠(yuǎn)緣嫁接砧穗的不親和性等因素減小了遠(yuǎn)緣嫁接成功的可能性,現(xiàn)有的研究還僅限于草本與草本植物、木本與木本植物之間的嫁接,而且對(duì)嫁接變異現(xiàn)象還沒有充分的遺傳理論基礎(chǔ),為此,本研究采用試管嫁接的方法,將大巖桐Sinningiaspeciosa,雞冠花Celosiacristata,長(zhǎng)壽花Kalanchoeblossfeldiana,黃色馬蹄蓮Zantedeschiaelliottiana,百合Liliumlongiflorum,蘋果Malusdomestica和陽桃Averrhoacarambola等7種植物進(jìn)行組合嫁接,以期對(duì)雙子葉與單子葉植物、草本與木本植物遠(yuǎn)緣嫁接模式進(jìn)行新的嘗試,并利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-simplesequencerepeat,ISSR)分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)成活的試管嫁接苗進(jìn)行分子水平的檢測(cè),以期獲得嫁接變異在DNA方面的證據(jù),從而增加嫁接引起可遺傳的變異的理論支持,也為后續(xù)的研究提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)參考。1材料和方法1.1馬蹄蓮病毒試材有大巖桐(苦苣苔科Gesneriaceae苦苣苔屬Sinningia),雞冠花(莧科Amaranthaceae青葙屬Celosia),長(zhǎng)壽花(景天科Crassulaceae伽藍(lán)菜屬Kalanchoe),黃色馬蹄蓮(天南星科Araceae馬蹄蓮屬Zantedeschia),百合(百合科Liliaceae百合屬Lilium),蘋果(薔薇科Rosaceae蘋果屬M(fèi)alus)及陽桃(酢漿草科Oxalidaceae陽桃屬Averrhoa),均為組織培養(yǎng)無菌體系,由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立。1.2測(cè)試方法1.2.1苗木樹的培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)18對(duì)嫁接組合。在超凈工作臺(tái)上,用磨尖的鑷子在砧木上面戳一個(gè)深3~5mm的孔,然后把下端表皮刮出傷口的接穗插入砧木上的孔中。嫁接苗接種于適合砧木增殖的培養(yǎng)基。接種30株·組合-1,重復(fù)3次。每天觀察砧木接穗的生長(zhǎng)狀態(tài)及結(jié)合部情況,40d后統(tǒng)計(jì)成活率及生長(zhǎng)情況。1.2.2pcr擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)的檢測(cè)(1)基因組DNA的提取:取嫁接成活植株及相應(yīng)接穗、砧木的嫩葉1~2片,約0.5g,采用王飛等的方法提取基因組DNA,用8g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),終質(zhì)量濃度調(diào)整至10mg·L-1。(2)ISSR擴(kuò)增:本研究采用多重優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系,20μL反應(yīng)體系中各組分的濃度分別為:1×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液,0.125mmol·L-1三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTP),2mmol·L-1氯化鎂,1×16.67nkatTaqDNA聚合酶,0.3μmol·L-1引物和20ng模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min,然后94℃變性1min,50℃退火45s,72℃延伸1.5min,35個(gè)循環(huán),72℃后延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用15g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。隨后進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)及分析。2結(jié)果與分析2.1不同生長(zhǎng)植株的成活率試驗(yàn)結(jié)果表明(表1),遠(yuǎn)緣植物之間的不同嫁接組合,嫁接的成活率有很大的差異。草本植物之間的所有嫁接組合均有不同程度的成活率,且差異顯著,最高成活率可達(dá)33.3%;單子葉與雙子葉植物的組合中,黃色馬蹄蓮(接穗)+長(zhǎng)壽花(砧木)、百合+大巖桐組合沒有成活植株,百合+長(zhǎng)壽花嫁接成活率較高,達(dá)15.0%;草本與木本植物的嫁接組合均未有成活植株。造成差異的主要原因可能是由于不同植物間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近造成的嫁接親和性的不同,同時(shí),與嫁接方法和嫁接技術(shù)的嫻熟度也有一定關(guān)系。2.2+大巖桐接穗生長(zhǎng)特性成活的遠(yuǎn)緣植物嫁接苗普遍表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢、衰弱或畸形。嫁接后45d,雞冠花+大巖桐的接穗在瓶?jī)?nèi)已經(jīng)開花,但生長(zhǎng)逐漸衰弱(圖1-1),從其接穗雞冠花上取莖段進(jìn)行增殖,增殖后代的葉片邊緣及葉脈出現(xiàn)細(xì)微的紅線(圖1-2),這與原株略有不同,且株型呈蓮座狀(圖1-3),伸長(zhǎng)生長(zhǎng)極緩慢。2.3接穗的擴(kuò)增位和接穗來源株的關(guān)系從100條ISSR引物中篩選出在接穗和砧木中有差異,且多態(tài)性明顯的引物用于檢測(cè)分析。嫁接苗ISSR檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2,可見嫁接苗擴(kuò)增位點(diǎn)存在以下3種情況(圖2):(1)偏親性位點(diǎn)。按照傳統(tǒng)遺傳學(xué)的觀點(diǎn),嫁接后代基因組應(yīng)該和接穗基因組一致,能夠保持母本的特性。長(zhǎng)壽花+大巖桐、長(zhǎng)壽花+雞冠花2個(gè)組合在嫁接后,接穗所擴(kuò)增出的位點(diǎn)和接穗來源株一致,未發(fā)生變化。(2)非親性擴(kuò)增位點(diǎn)。大巖桐+雞冠花、大巖桐+長(zhǎng)壽花、雞冠花+大巖桐、大巖桐+雞冠花等4個(gè)組合嫁接后一些接穗的擴(kuò)增條帶與接穗和砧木來源株相比較,表現(xiàn)位點(diǎn)缺失或者出現(xiàn)新的位點(diǎn)。這種變化可能是由于遠(yuǎn)緣嫁接所致。(3)雙親雜合位點(diǎn)。嫁接苗雜合接穗與砧木來源株的位點(diǎn),如雞冠花+大巖桐、大巖桐+雞冠花嫁接成活苗。這說明,嫁接后砧木與接穗產(chǎn)生相互影響,可能發(fā)生了大分子物質(zhì)的交流,從而使砧木的某些遺傳信息整合到了接穗的遺傳物質(zhì)中。產(chǎn)生位點(diǎn)變化的嫁接苗,初始外觀性狀表現(xiàn)與原來差異并不大。對(duì)雞冠花+大巖桐組合的接穗進(jìn)行增殖,并對(duì)增殖后代進(jìn)行ISSR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)來自砧木的條帶在增殖后代中仍然存在。3討論3.1嫁接成活率分析親和力被認(rèn)為是嫁接成活的基本條件,植物嫁接的親和性機(jī)制問題也是目前嫁接理論研究中的熱點(diǎn)。接穗與砧木在分類學(xué)上的關(guān)系愈近,嫁接成功率就越高;分類學(xué)上的關(guān)系愈遠(yuǎn),排斥現(xiàn)象愈強(qiáng)烈,嫁接就越不容易成功。在本研究中,不同嫁接組合的嫁接成活率各不相同,差異也比較大,從草本與木本植物、單子葉與雙子葉植物、草本植物之間嫁接成活率來看,草本與木本植物之間由于其組織結(jié)構(gòu),內(nèi)部代謝等方面都大相徑庭,親和性比較差,因而嫁接成功的難度非常大。相對(duì)而言,草本植物之間的嫁接成活率要大一些,單子葉和雙子葉植物間也有少量成活的嫁接苗。另外,遠(yuǎn)緣試管嫁接的成活率還與嫁接組合,嫁接技術(shù)條件,嫁接方法,砧穗形態(tài)大小,甚至試驗(yàn)操作者的熟練程度等多種因素相關(guān),因而它并不能夠作為親和力強(qiáng)弱的絕對(duì)指標(biāo)。3.2轉(zhuǎn)座子理論在基因測(cè)序中的應(yīng)用嫁接可以引起可遺傳的變異,但嫁接變異的機(jī)制至今還不確定,過去在有關(guān)遠(yuǎn)緣嫁接遺傳變異的研究中,都推測(cè)可能是砧木中的某些DNA片段被轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗中所致,但至今未獲得此方面直接的分子生物學(xué)證據(jù)。McClintock最早提出了轉(zhuǎn)座子的概念,并進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,正常情況下,轉(zhuǎn)座子不表現(xiàn)活性或活性很低,但創(chuàng)傷、原生質(zhì)體分離、組織培養(yǎng)和病毒、細(xì)菌或真菌的感染等環(huán)境壓力?？杉せ钷D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座,使基因發(fā)生重排,適應(yīng)逆境的突變存活下來。本研究中,用ISSR分析檢測(cè)到幾