代謝組學(xué)原理與中醫(yī)思維研究

代謝組學(xué)原理與中醫(yī)思維研究

代謝組學(xué)由英國科學(xué)家尼霍諾夫和其他科學(xué)家首次提出。近年來，它發(fā)展迅速，成為國際研究的熱點。代謝組學(xué)是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后),其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化,來研究生物體系的一門科學(xué)。系統(tǒng)生物學(xué)的數(shù)據(jù)絕大多數(shù)來自于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)?；蚪M學(xué)研究反映了什么是可以發(fā)生的,轉(zhuǎn)錄組學(xué)則反映的是將要發(fā)生的,蛋白質(zhì)組學(xué)指出的是賴以發(fā)生的,而只有代謝組學(xué)才真正反映出業(yè)已發(fā)生的。作為表型區(qū)分、差異表述和標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的有力工具,與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等其他組學(xué)相比,代謝組學(xué)具有以下優(yōu)點:①基因和蛋白表達(dá)的微小變化會在代謝物水平得到放大;②代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫;③代謝物的種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白質(zhì)的數(shù)目;④生物體液的代謝物分析可以反映機體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域中最為活躍的分支學(xué)科之一,在疾病診斷、藥物開發(fā)、新藥毒性評價以及植物和微生物的研究中已經(jīng)得到成功的應(yīng)用。由于代謝組學(xué)技術(shù)原理與中醫(yī)基本理論和診療思維有異曲同工之處,為研究復(fù)雜的中醫(yī)理論和中醫(yī)藥的現(xiàn)代化提供了新的思路和研究平臺。1謝菲爾德學(xué)對中醫(yī)的研究代謝組學(xué)思想與中醫(yī)理論思維相吻合,用于中醫(yī)藥研究具有“天然”的優(yōu)勢,主要體現(xiàn)在以下幾個方面。1.1“影之似形”與代謝組學(xué)研究中醫(yī)理論重要的思維特點,是從“象”測“藏”,以表知里。在中醫(yī)對生命現(xiàn)象的認(rèn)知上,運用“司外揣內(nèi)”的方法“視其外應(yīng)以知其臟,則知所病矣”(《靈樞·本藏第四十七》),“內(nèi)外相襲,若鼓之應(yīng)桴,響之應(yīng)聲,影之似形”(《靈樞·外揣第四十五》),所描述生理和病理現(xiàn)象,是一種“通過觀察表象去理解體內(nèi)變化”的方法。《內(nèi)經(jīng)》形象地比喻為“下有漸洳,上生葦蒲,此所以知形氣之多少也”。由于生物體受毒物、疾病、藥物等干擾后,內(nèi)源性物質(zhì)會做出相應(yīng)的代謝響應(yīng),這種代謝變化能表達(dá)成為特定的代謝指紋圖譜,代謝組學(xué)研究的思路就是通過一系列的數(shù)據(jù)采集手段得到包含全部代謝產(chǎn)物(主要是相對分子質(zhì)量小于1000的分子)信息的指紋圖譜,并利用化學(xué)計量學(xué)的手段對這些信息進(jìn)行提取,找出有用的信息。這與中醫(yī)學(xué)“司外揣內(nèi)”的認(rèn)知思維是一致的。特別是代謝組學(xué)的技術(shù)能夠?qū)铙w進(jìn)行無損傷性、接近生理條件的動態(tài)研究,是一種適合中醫(yī)理論體系的新的觀察方法。1.2對人體整體發(fā)展的認(rèn)識中醫(yī)學(xué)崇尚“天人合一”的思想,在人與自然的關(guān)系上,指出“人與天地相參也,與日月相應(yīng)也。”(《靈樞·歲露論第七十九》)以中醫(yī)為代表的中國傳統(tǒng)科學(xué)把復(fù)雜事物當(dāng)作整體研究,并注重在不同層面、單元之間的連接和組合方式。中醫(yī)理論的這種整體恒動觀貫穿在中醫(yī)學(xué)的生理、病理、診斷、防治等各個方面。它把人體看作是一個以臟腑經(jīng)絡(luò)為內(nèi)在聯(lián)系的有機整體,認(rèn)為疾病的發(fā)生和發(fā)展是由于臟腑經(jīng)絡(luò)之間陰陽平衡失調(diào),機體與外在環(huán)境的對立統(tǒng)一被破壞的結(jié)果;在辨證上重視臟腑之間病變的影響,對患者體質(zhì)、當(dāng)時反應(yīng)狀態(tài)以及所處的自然環(huán)境進(jìn)行綜合分析,決不孤立地看局部病變。代謝組學(xué)研究表明,環(huán)境因素如飲食狀況、氣候變化以及情緒等心理和社會因素會影響人體生物功能的調(diào)節(jié),使代謝產(chǎn)物發(fā)生潛移默化的變化。因此,代謝組學(xué)的研究不僅僅把人作為一個孤立的體系,而是把人與環(huán)境、形體與精神之間的相互作用加以綜合考慮。這種思想與中醫(yī)學(xué)所強調(diào)的人與自然、社會環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展的整體恒動觀是十分契合的。1.3缺乏有效的現(xiàn)代科學(xué)表達(dá)體系中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶,是幾千年臨床經(jīng)驗的沉淀與樸素唯物主義哲學(xué)觀升華的結(jié)晶,其在人類健康事業(yè)中的重要地位不容置疑。但是,也應(yīng)清醒地認(rèn)識到中醫(yī)藥認(rèn)識疾病的方法、理論均缺乏合適的現(xiàn)代科學(xué)表達(dá)體系,目前仍是一種不能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相兼容、相通的“語言”。系統(tǒng)生物學(xué)尤其是代謝組學(xué)的誕生,使得中西醫(yī)結(jié)合“橋梁”的輪廓逐漸清晰。由于代謝組學(xué)與中醫(yī)學(xué)在學(xué)術(shù)內(nèi)涵上具有上述相通性,有助于用現(xiàn)代語言對中醫(yī)理論進(jìn)行詮釋,構(gòu)建現(xiàn)代中醫(yī)理論體系,以適應(yīng)時代發(fā)展的需求和自我價值的提升。2代謝組學(xué):區(qū)域性突破2006年9月13—14日,第284次香山科學(xué)會議召開,其主題就是“醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)”。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,代謝組學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代化目標(biāo)的結(jié)合將是我國民族醫(yī)藥發(fā)展歷程中的戰(zhàn)略性突破。目前采用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證候、中藥藥效、中醫(yī)藏象、中醫(yī)體質(zhì)等工作正在開展,有些已經(jīng)取得了階段性成果,為更廣泛、更深入的研究積累了經(jīng)驗。2.1代謝組學(xué)的作用近年來,證候的基因組學(xué)研究、蛋白組學(xué)研究乃至代謝組學(xué)研究已經(jīng)取得一定成果,并預(yù)示出良好的發(fā)展前景。特別是將代謝組學(xué)研究的方法運用到證候研究中,可以無傷害性地動態(tài)檢測機體生物液體中代謝產(chǎn)物譜的變化,動態(tài)評價機體的功能狀態(tài),與證候動物模型研究相比,更接近人體本身的生理、病理狀態(tài),更能反映證候的本質(zhì)。采用代謝組學(xué)技術(shù),通過對某一病證相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷,能夠幫助人們更好地理解病變過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況;同時,代謝組學(xué)還有助于疾病的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)而達(dá)到輔助臨床診斷的目的。中醫(yī)證候代謝組學(xué)研究技術(shù)是通過采集證候樣本或模型動物的血漿、尿樣品并進(jìn)行代謝產(chǎn)物譜分析,得到各自的代謝產(chǎn)物譜,找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物,用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能,以確定“證相關(guān)代謝譜群”。也可以用方證反證的方式驗證方藥的作用機制和進(jìn)行方證相關(guān)性的研究。如LiLin等應(yīng)用核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)技術(shù)分析了氣虛血瘀證模型鼠的尿液代謝物,研究發(fā)現(xiàn),模型組與正常組相比在甲酸鹽、肌酐等產(chǎn)物中存在差異。陸益紅等應(yīng)用氣相色譜(gaschromatography,GC)和(或)質(zhì)譜(massspectrography,MS)技術(shù)測定了健康人及原發(fā)性高血壓患者的血清內(nèi)源性代謝物,利用馬氏距離方法可以清晰地區(qū)分3種證型的高血壓及其發(fā)展過程。陳閩軍等采用GC和(或)MS技術(shù),發(fā)現(xiàn)腎陽虛模型動物的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常組動物,而用溫陽中藥干預(yù)后,模型動物的代謝譜回歸至正常范圍,呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的效果。2.2對人尿中代謝的影響眾所周知,中藥的作用特點體現(xiàn)在多組分、多靶點效應(yīng)在時間和空間上的協(xié)同整合,從而表現(xiàn)出較強的整體藥效作用,但就單一藥效作用而言,中藥的作用與相應(yīng)的化學(xué)藥物相比通常較弱,這也是為什么不能簡單應(yīng)用評價化學(xué)藥物的方法進(jìn)行中藥藥效作用評價的根本原因。代謝組即時反映生物體整體功能狀態(tài)及其終點放大的優(yōu)勢,對于建立符合中藥多組分、多靶點協(xié)同整合效應(yīng)特征的新型藥效評價體系,無疑具有重要意義。如車慶明等從口服黃芩苷的人尿液中,發(fā)現(xiàn)并鑒定了3個主要代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),證明黃芩苷元是主要藥物代謝產(chǎn)物的中間體,它們在體內(nèi)共存,構(gòu)成黃芩苷的藥效。日本學(xué)者安田高明在大鼠尿中鑒定出5個葛根湯代謝物,而在人尿中則只有一個代謝物。譚銳等對麻黃標(biāo)準(zhǔn)湯在人工胃、腸液中和大鼠灌胃給藥后的不同時間段胃、腸、血液中的活性成分變化進(jìn)行了比較,進(jìn)一步證實麻黃堿和甘草酸作為活性成分能被機體迅速吸收。張磊藝等研究銀杏葉提取物對糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝的影響,結(jié)果表明銀杏葉提取物治療組較糖尿病對照組的總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、膽固醇明顯降低(P<0.01),糖尿病組腸道菌群較正常組發(fā)生明顯變化(P<0.01),尤其雙歧桿菌、乳桿菌等明顯減少,而治療后腸道菌群得到調(diào)整。這表明銀杏葉提取物可能通過扶植腸道菌群有益菌的生長繁殖對脂質(zhì)代謝發(fā)揮作用,從而達(dá)到其調(diào)脂目的。中藥(尤其是復(fù)方)的整體性作用機制和療效在系統(tǒng)代謝組學(xué)的研究方法下將可能得到充分的展示和“挖掘”。從代謝物角度解釋中藥毒性作用機制,是中藥藥理研究的新思路。正常的細(xì)胞由于藥物的“毒性和不良反應(yīng)”而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)功能破壞,改變代謝的內(nèi)源性代謝物,從而直接或間接改變被檢驗的物質(zhì)成分,然后利用先進(jìn)的檢驗技術(shù)和模式識別系統(tǒng),定性或定量檢測體內(nèi)某種生物分子或代謝物的動態(tài)變化,可以作為毒性損害的評價指標(biāo)。目前研究較多的是具有典型肝腎毒性的中藥。趙劍宇等利用NMR技術(shù)研究了關(guān)木通的腎毒性,發(fā)現(xiàn)染毒后大鼠腎臟出現(xiàn)不同程度的炎性壞死,尿液代謝譜有明顯差異,并初步推斷出造成組間差異的主要影響因素。張曉宇等也采用NMR對馬兜鈴酸的毒性進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。王廣基等基于氣相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatography-timeofflight-massspectrometry,GC-TOF-MS)代謝組學(xué)研究方法開展了雷公藤甲素肝腎毒性相關(guān)研究工作,發(fā)現(xiàn)其急性毒性存在一定的劑量相關(guān)性,同時在高劑量(每日2.4mg/kg)狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)作為肝臟受損指標(biāo)的牛璜酸(taurine)水平增加,而李建新等應(yīng)用每日0.4mg/kg的劑量并沒有發(fā)現(xiàn)肝臟毒性變化,提示代謝組學(xué)研究結(jié)果將有利于從整體水平確定藥物的治療窗,相比于單指標(biāo)的藥效和(或)毒性評價更為可靠。2.3中醫(yī)藏象學(xué)與代謝組學(xué)在方法論中,把內(nèi)部結(jié)構(gòu)一時無法直接觀察而靠外部去認(rèn)識的現(xiàn)實系統(tǒng)稱為黑箱?？啃畔⒈孀R來判斷黑箱結(jié)構(gòu)和功能的方法稱為黑箱方法。黑箱的信息觀察是以整體性和動態(tài)性為特征,中醫(yī)學(xué)藏象、經(jīng)絡(luò)等理論是司外揣內(nèi)的黑箱方法的具體運用。中醫(yī)藏象學(xué)是研究內(nèi)在的生命本質(zhì)與外在現(xiàn)象的關(guān)系,揭示臟腑與形體諸竅、自然環(huán)境關(guān)系的學(xué)說?！安亍笔遣赜隗w內(nèi)的臟腑,外不可見;“象”,是形見于外的生理病理現(xiàn)象,是可見的表現(xiàn),可預(yù)測的征兆?！跋蟆奔仁腔谂K腑的,更是表現(xiàn)于代謝的,反映了臟腑氣血的強弱多少,也反映了代謝的動態(tài)變化。不同臟腑表現(xiàn)出來的生理現(xiàn)象是機體在不同環(huán)境下代謝結(jié)果的集中體現(xiàn)。代謝組學(xué)區(qū)別于基因組學(xué)和蛋白組學(xué),它關(guān)注的重心是黑箱外暴露出的現(xiàn)象,透過這種現(xiàn)象推測黑箱內(nèi)發(fā)生的巨變。代謝組學(xué)可以通過對“黑箱”外代謝產(chǎn)物和代謝網(wǎng)路的變化,推斷機體受到各種外界因素影響后的最終結(jié)果。最近,廣東省廣州市等單位正在利用代謝組學(xué)技術(shù)開展“脾在液為涎”等中醫(yī)藏象學(xué)說的相關(guān)課題。2.4差異表達(dá)基因的基因組學(xué)檢測進(jìn)展體質(zhì)是指人體生命過程中,在先天稟賦和后天獲得的基礎(chǔ)上所形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理狀態(tài)方面綜合的、相對穩(wěn)定的固有特質(zhì)。由于遺傳因素的多樣性與后天因素的復(fù)雜性,使個體體質(zhì)存在明顯的差異;而即使同一個體,在不同的生命階段其體質(zhì)特點也是動態(tài)可變的,所以體質(zhì)呈現(xiàn)多態(tài)性特征。同時,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,陰陽、氣血、津液是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),而體質(zhì)現(xiàn)象即是體內(nèi)陰陽、氣血、津液盛衰變化的反映狀態(tài)。因而,從理論上講,通過對不同體質(zhì)代謝產(chǎn)物的檢測,能夠找到體質(zhì)差異的客觀物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已有的分子生物學(xué)研究、生理生化指標(biāo)檢測均發(fā)現(xiàn)了體質(zhì)差異客觀存在的依據(jù)。如王琦等研究發(fā)現(xiàn)陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)與平和質(zhì)比較具有獨特的基因表達(dá)譜,并通過對PPARD、PPARG、APMI和UCP24個基因多態(tài)性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)這4種體質(zhì)類型分別具有特定的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)分布和特定的單倍型分布;發(fā)現(xiàn)陽虛質(zhì)甲狀腺激素受體β(thyroidreceptor-β,TRβ)表達(dá)下調(diào),為陽虛質(zhì)不耐寒冷的表現(xiàn)提供了分子生物學(xué)解釋;發(fā)現(xiàn)與平和質(zhì)相比,痰濕質(zhì)存在拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNVs)和差異表達(dá)基因單核苷酸多態(tài)性特征,初步檢測出15個CNV,分布在1,5,7,8,9,13,15,16,22號染色體,CNV類型主要為刪除及同一基因座刪除和擴增的混合表現(xiàn),長度為1~100kb,初步篩選出5個差異表達(dá)基因共6個SNP位點,SNP位點分別為rs4237775,rs174455,rs2303536,rs9967820,rs4149268,rs16873516,進(jìn)一步對相關(guān)基因功能分析顯示痰濕體質(zhì)者具有代謝紊亂的總體特征;發(fā)現(xiàn)陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)與下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能減退,及與環(huán)核苷酸系統(tǒng)和免疫功能紊亂具有一定的關(guān)聯(lián)性,部分痰濕質(zhì)存在血脂代謝紊亂、糖代謝障礙及嘌呤類代謝障礙。如果說基因及蛋白質(zhì)的存在為生物過程的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ),而代謝物質(zhì)和代謝表型所反映的是已經(jīng)發(fā)生了的生物學(xué)事件,是基因型與環(huán)境共同作用的綜合結(jié)果,是生物體系生理和生化功能狀態(tài)的直接體現(xiàn),那么,在實踐上可以肯定,代謝組學(xué)研究能夠發(fā)現(xiàn)體質(zhì)差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,體質(zhì)與證候是兩個密切相關(guān),但又處于不同層次的認(rèn)知模式。體質(zhì)是生命、健康、疾病的載體,體質(zhì)可綜合反映機體整體狀態(tài)特征,證候是疾病狀態(tài)下的臨床類型,反映疾病演進(jìn)過程中的病理特征,二者既有區(qū)別,又有聯(lián)系。為了說明這一理論,筆者所在課題組正在進(jìn)行“證候病機與體質(zhì)的代謝組學(xué)相關(guān)研究”,通過運用代謝組學(xué)NMR技術(shù),比較分析陽虛、陰虛體質(zhì)與陽虛、陰虛證的代謝指紋圖譜差異,并尋找體質(zhì)和證候的生物標(biāo)志物,為揭示兩者的關(guān)系提供客觀依