大鼠腦缺血再灌注后nelin和scf基因表達(dá)的變化

大鼠腦缺血再灌注后nelin和scf基因表達(dá)的變化

神經(jīng)干燥物（ius）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有分裂和分化能力的細(xì)胞。它是神經(jīng)發(fā)育的一個(gè)特定細(xì)胞，可以長期保持其分裂和分化能力。巢蛋白(nestin)是神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)常用的分子標(biāo)記物,它是一種僅存在于神經(jīng)上皮干細(xì)胞的中間絲成分,其表達(dá)有特定的時(shí)序性。研究表明,缺氧誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)再生;干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF)和成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)是缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)再生的因子;SCF可能刺激整體動(dòng)物神經(jīng)再生。本研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物nestin和SCF表達(dá)的變化,以探討腦缺血再灌注后神經(jīng)干細(xì)胞增殖水平的變化。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒊赡杲】荡菩許D大鼠36只,體重230~280g,清潔級(jí),由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動(dòng)脈插線建立左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)再灌注模型,隨機(jī)分為缺血1.5h再灌注2h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d組和假手術(shù)組,每組4只。假手術(shù)組除不插線外,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。二、腦電pc各組動(dòng)物在規(guī)定的時(shí)間里取材,假手術(shù)組于術(shù)后24h取材。大鼠在10%水合氯醛(300mg/kg體重)麻醉下,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,依次灌入生理鹽水200ml、4%多聚甲醛300ml,灌注完畢后開顱,于前囟前2mm至前囟后3mm之間取腦,切塊厚度5mm,置入4%多聚甲醛(含1/5000DEPC)中固定2h,蒸餾水浸泡4h。常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋。于前囟前1mm至前囟后2mm之間連續(xù)冠狀切片,厚度7μm,粘于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的玻片上,置入37℃烤箱過夜后室溫保存,用于nestin和SCF原位雜交及其對(duì)照實(shí)驗(yàn)。三、dab顯色法nestin和SCFmRNA原位雜交試劑盒、DAB試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。按照試劑盒說明操作,DAB顯色,光鏡下觀察,細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。取部分切片不加探針以0.1MPBS代替,不出現(xiàn)陽性細(xì)胞,說明探針特異性強(qiáng)。四、陰性細(xì)胞計(jì)數(shù)高倍鏡下(×400)在皮層、紋狀體和室旁區(qū)隨機(jī)各取4個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞,各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)以(ˉx±s)(xˉ±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn)。結(jié)果一、組患者未盡事宜性變化的不良反應(yīng)比較假手術(shù)組皮質(zhì)、紋狀體和室旁區(qū)nestin表達(dá)很弱。實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)皮質(zhì)nestin的表達(dá)于再灌注2h后開始增高,但與假手術(shù)組比較無顯著性差異,自6h開始有顯著性增高,至24h達(dá)高峰,2d回落,7d又出現(xiàn)最高峰,以后漸降低,14d仍較假手術(shù)組高;紋狀體和室旁區(qū)nestin的表達(dá)規(guī)律與皮質(zhì)區(qū)基本一致,但其增高自12h始出現(xiàn)顯著性差異;至14d室旁區(qū)nestin表達(dá)已恢復(fù)至假手術(shù)組水平。具體數(shù)據(jù)詳見表1。二、scf的表達(dá)假手術(shù)組皮質(zhì)、紋狀體和室旁區(qū)SCF表達(dá)很弱。實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)皮質(zhì)SCF的表達(dá)于再灌注2h后開始增高,但與假手術(shù)組比較無顯著性差異,自24h開始有顯著性增高,2d回落,3d、7d增高,7d出現(xiàn)最高峰,以后漸降低,14d仍較假手術(shù)組高;紋狀體和室旁區(qū)SCF的表達(dá)規(guī)律與皮質(zhì)基本一致,但紋狀體SCF增高自12h、室旁區(qū)自6h始出現(xiàn)顯著性差異;至14d室旁區(qū)SCF表達(dá)已恢復(fù)至假手術(shù)組水平。具體數(shù)據(jù)詳見表2。討論一、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞缺乏成熟神經(jīng)細(xì)胞所具有的抗原,而存在一種作為神經(jīng)外胚層標(biāo)記物的nestin(巢蛋白,即神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白,neuroepithelialstemprotein),系早期原始神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志,故可應(yīng)用nestin免疫反應(yīng)確定神經(jīng)干細(xì)胞的存在。在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,一定數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞以休眠、不增殖狀態(tài)存活在腦內(nèi)并受中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或變性時(shí),由于細(xì)胞微環(huán)境的改變(如出現(xiàn)某些細(xì)胞因子),神經(jīng)干細(xì)胞被激活(或抑制因子失活),在損傷原位出現(xiàn)或異位增生后,在趨化因子的作用下向損傷部位遷移并分化。也有學(xué)者認(rèn)為,成熟神經(jīng)細(xì)胞的逆向分化是內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的來源之一。他們認(rèn)為,在腦缺血或其它神經(jīng)系統(tǒng)的病理狀態(tài)下,成熟細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞骨架的胚胎回復(fù),出現(xiàn)胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞特性的再表達(dá)。此類細(xì)胞可能是星形細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。Li等用MCAO法制作大鼠局灶性腦缺血模型,于再灌注后2、3、6、12h和1、2、3、7、8d取腦組織用Western印跡法作巢蛋白定量分析,結(jié)果顯示,nestin在第7天達(dá)高峰。這些資料表明,腦缺血后,機(jī)體通過誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增多而對(duì)缺血損傷產(chǎn)生代償性適應(yīng)性反應(yīng)。本研究實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與此基本一致。二、scf受體的功能SCF是一種細(xì)胞活素,它可在心臟和其它器官影響功能、生長和凋亡,它是心肌愈合中對(duì)肥大細(xì)胞有力的生長和趨向性因子。而在神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性生長因子(BDGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)等的共同作用下,SCF可作為神經(jīng)干細(xì)胞的存活因子刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖。腦缺血能刺激嚙齒類動(dòng)物增生區(qū)神經(jīng)再生。缺氧增加溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)進(jìn)入細(xì)胞,表達(dá)出增殖標(biāo)志物以及幼稚神經(jīng)元標(biāo)記物,而沒有證據(jù)證實(shí)DNA破壞或半胱氨酸激酶3(Caspase-3)的激活。缺氧及干細(xì)胞因子刺激BrdU進(jìn)入培養(yǎng)基。SCF受體在成年大鼠的增生區(qū)及培養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá),整體動(dòng)物給予SCF能增加BrdU標(biāo)記的幼稚神經(jīng)元。有研究表明,缺氧導(dǎo)致小鼠皮質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞神經(jīng)再生,這種作用是通過分泌SCF而出現(xiàn)的,SCF刺激培養(yǎng)細(xì)胞和整體動(dòng)物皮質(zhì)側(cè)腦室旁區(qū)(SVZ)和海馬齒狀核顆粒下層(SGZ)神經(jīng)再生。還有許多因子可以刺激神經(jīng)再生,如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)。有個(gè)案報(bào)道加入神經(jīng)生長因子或過度表達(dá)該因子可以增加成人大腦整體狀態(tài)下的神經(jīng)再生。另有文獻(xiàn)報(bào)道,半球缺血觸發(fā)SGZ區(qū)的神經(jīng)再生,局灶性缺血誘發(fā)缺血周邊區(qū)皮質(zhì)再生,而局灶性腦缺血與FGF-2在海馬齒狀核祖細(xì)胞的增生有關(guān)。以往有研究顯示,小鼠短暫性前腦缺血15min后,齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖加速,再灌注3、7和10d時(shí)齒狀回和腦室周圍區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)增加,尤以7d時(shí)數(shù)量最多。Zhang等報(bào)道,成年MCAO大鼠除了室下區(qū)有神經(jīng)干細(xì)胞外,損傷側(cè)大腦皮質(zhì)也存在神經(jīng)干細(xì)胞增殖。腦缺血后2~14d,大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞增多,7d達(dá)高峰,28d后大量減少。本