一種多酚類物質(zhì)干擾rna的提取方法

一種多酚類物質(zhì)干擾rna的提取方法

得到良好的rna是生物因素[1.3]中引入的一個(gè)挑戰(zhàn)問題。雖然已經(jīng)建立了許多方法來分離和提取內(nèi)部信息，但由于豐富的探針、茶多酚和其他物質(zhì)或難以溶解rna，許多實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)常阻礙艱難的實(shí)驗(yàn)失敗。另一方面,miRNA,snoRNA,snRNA等小RNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要分子,廣泛調(diào)控生物的發(fā)育、代謝以及抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復(fù)的基因組序列)的侵害及逆境適應(yīng)性.有關(guān)小RNA與基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系的研究以及基因工程與基因治療等方面的應(yīng)用研究已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[8~10].因此,小RNA的分離純化也是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作.目前,小RNA的提取是利用SDS從總RNA中分離純化[11~13],其純化過程繁瑣復(fù)雜,得率低.本文報(bào)道利用硅藻土能夠有效吸附RNA酶的特性,結(jié)合高鹽、PVP及乙二醇丁醚沉淀等過程,建立了高效高質(zhì)量RNA提取方法.該方法適應(yīng)性廣,可以從富含RNase及多糖、多酚等代謝產(chǎn)物提取RNA困難的動(dòng)、植物及微生物材料中提取高質(zhì)量總RNA,通過結(jié)合LiCl與PEG8000加NaCl沉淀去除大片段RNA,有效富集了小RNA.1材料和方法1.1玉米和麻蜂植物:富含多酚的麻瘋樹幼葉、蓖麻樹幼葉、烏桕樹幼葉、銀杏樹幼葉、蘆薈葉片,富含多糖的灌漿期玉米胚乳,水稻幼苗以及油脂豐富的麻瘋樹種子.動(dòng)物:富含RNase的家兔肝臟.微生物:木霉、酵母.1.2dy-1型的紫外凝膠成像系統(tǒng)、pcr儀和pcr儀冷凍離心機(jī):Centrifuge5804R(Eppendorf公司).電泳儀:DYY-Ⅲ1型穩(wěn)壓儀(北京六一儀器廠).紫外凝膠成像系統(tǒng):BioIMAGINGSYSTEM(SYNGENE).紫外可見分光光度計(jì):TU-1800(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).PCR儀:Personalcycler(Biometra公司).1.3方法1.3.1國產(chǎn)分析純?cè)噭〥EPC、EDTA購自Amresco公司;瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品;硅藻土、水飽和酚(pH4.7)、氯仿、異戊醇、5mol/LKAc(pH4.8)、75%乙醇、無水乙醇、乙二醇丁醚、SDS、檸檬酸鈉、Tris、HCl、2-巰基乙醇、水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5mol/LNaCl、8mol/LLiCl、50%PEG8000、1mol/LMgCl2等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?1.3.2提取緩沖液.a.硅藻土的處理:5g硅藻土用50ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)溶解,于100℃放置5min.室溫2500g離心5min.棄上清,沉淀用40ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)重懸.重復(fù)離心和重懸的步驟兩次.超聲1min.室溫3500g離心15min.沉淀用30ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)重懸.4℃儲(chǔ)存.b.硅藻土提取緩沖液:20mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0),10mmol/LEDTA,0.5%SDS,1%2-巰基乙醇,100mmol/LNaCl,1.9g/L處理過的硅藻土.(121℃高壓滅菌20min,冷卻后再加入1%2-巰基乙醇,4℃保存).c.異硫氰酸胍提取緩沖液:按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)所用的塑料制品均經(jīng)氯仿處理5min后,121℃高壓滅菌20min,玻璃、陶瓷器皿200℃干熱滅菌8h.1.3.3提取緩沖液depc-2e全過程均在冰上操作,保持樣品溫度在0~4℃.a.硅藻土-苯酚法.樣品液氮速凍,于研缽中研磨成細(xì)微粉末并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管,按照4ml/g的比例加入硅藻土提取緩沖液,充分震蕩后加入1/2體積的水飽和酚和1/2體積的氯仿∶異戊醇(24∶1),震蕩混勻.4℃12000g離心10min,取上清加入等體積5mol/LKAc(pH4.8),混勻后冰浴10min,4℃13000g離心10min.液相轉(zhuǎn)入新管,重復(fù)上述酚仿抽提,直至界面清亮.上清移入新管,加入等體積乙二醇丁醚,混合均勻后,冰上放置1h.4℃14000g離心15min.沉淀用75%乙醇洗2次,空氣干燥后用適量DEPC-H2O溶解,-70℃保存.對(duì)于銀杏等多酚材料則在研磨及加提取緩沖液過程中添加2%~4%的PVP.先進(jìn)行氯仿抽提,再酚/氯仿抽提,其他同上.b.異硫氰酸胍法.實(shí)驗(yàn)操作按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行.c.TRIZOL法.試劑盒購自Invitrogen公司,實(shí)驗(yàn)方法按說明書進(jìn)行.1.3.4b.rna純度分析a.RNA電泳分析.RNA的完整性用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳,然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察.b.RNA純度鑒定.取1!l樣品,用DEPC-H2O稀釋30倍,紫外分光光度計(jì)測量其在230、260和280nm處的紫外吸光值(A).每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值.以A260/A280,A260/A230比值做純度分析.1.3.5rt-pcr擴(kuò)增水稻幼苗在液氮中研磨成粉末并倒入預(yù)冷的離心管,根據(jù)樣品質(zhì)量按照3~4ml/g的比例加入硅藻土提取緩沖液,充分震蕩混勻.酚仿抽提后加入1/3體積的8mol/LLiCl,混勻,-20℃放置至少30min.2℃15000g離心10min.上清用50%PEG8000和5mol/LNaCl(每400μl上清加入50%PEG800050μl和5mol/LNaCl50μl)混勻,-20℃放置至少30min.2℃15000g離心10min.上清再重復(fù)一次PEG-NaCl沉淀步驟.上清移入新管,加入2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的1mol/LMgCl2,-20℃放置至少2h.2℃15000g離心30min.棄液相,沉淀用75%乙醇洗2次,干燥后溶于適量DEPC-H2O中,-70℃保存?zhèn)溆?RT-PCR按TaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶操作手冊(cè)進(jìn)行.所用引物(由TaKaRa公司合成)根據(jù)麻瘋樹18S核糖體RNA基因序列設(shè)計(jì).5′引物P1,5′ATTTCTGCCCTATCAACTTT3′,3′引物P2,5′CCAAGGTCCAACTACGAGC3′.cDNA模板在94℃變性4min后,按94℃30s,53℃1min,72℃1min程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán),最后72℃保溫10min.以未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的PCR和不加模板的RT-PCR產(chǎn)物為對(duì)照.擴(kuò)增結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.Osa-miR156是已經(jīng)證明可在水稻幼苗中檢測出來的miRNATMRTreagentKit說明書進(jìn)行.RT-RCR反應(yīng)步驟為42℃10min,95℃2min.cDNA模板在95℃變性4min,擴(kuò)增(95℃30s,55℃1min,72℃1min)35個(gè)循環(huán);72℃保溫10min.以未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的PCR和不加模板的RT-PCR產(chǎn)物為對(duì)照.擴(kuò)增結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.2結(jié)果2.1檸不同緩沖劑的研制在本方法設(shè)計(jì)過程中,首先考慮的是緩沖劑的選擇.我們選用H2O、200mmol/L的Tris-HCl和25mmol/L的檸檬酸鈉.由1%瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出(圖1),三種方案都可以從麻瘋樹葉片中提取出RNA.但是,以檸檬酸鈉為緩沖劑的提取產(chǎn)量最高,Tris-HCl次之.故而選定檸檬酸鈉作為提取液中的緩沖劑成分,進(jìn)一步篩選最佳濃度.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5、10、15、20、25、30、35、40、45mmol/L等9種不同的檸檬酸鈉濃度.結(jié)果表明,檸檬酸鈉濃度在15~30mmol/L范圍時(shí)效果均很好,表現(xiàn)為RNA條帶清晰,亮度高,無彌散帶,28S條帶是18S條帶的2倍(圖2).在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用緩沖劑檸檬酸鈉的濃度為20mmol/L.2.2硅藻土濃度對(duì)rna提取效果的影響接下來考察RNA提取緩沖液中硅藻土的最佳濃度.我們分別在1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2g/L等不同的硅藻土濃度下提取麻瘋樹葉片的RNA.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,硅藻土濃度為1.9g/L時(shí)RNA產(chǎn)量最高,效果最好(圖3).2.3沉淀時(shí)間和沉淀時(shí)間對(duì)乙二醇丁醚沉淀效果的影響RNA提取過程中,廣泛應(yīng)用的沉淀劑主要有無水乙醇、異丙醇.最近的研究報(bào)道,乙二醇丁醚具有不錯(cuò)的沉淀效果.我們?cè)诮⒈痉椒ㄟ^程中也引入這3種沉淀劑沉淀30min.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,乙二醇丁醚的沉淀效果最好(圖4).在沉淀時(shí)間上,10~60min范圍內(nèi)隨著沉淀時(shí)間的加長,乙二醇丁醚沉淀效果增強(qiáng)(圖5),而沉淀2h的效果基本與沉淀1h相同.2.4離心15min的情況對(duì)于離心力大小與離心時(shí)間,我們選用了4℃12000g及13000g離心20min,選用13000g與14000g離心15min等條件.結(jié)果顯示,14000g離心15min的效果較好(圖6).2.5異硫氰酸醚法與異硫氰酸醚法的比較與異硫氰酸胍法、TRIZOL法等實(shí)驗(yàn)室常用方法比較,本文建立的方法分離提取多糖、多酚的麻瘋樹綠色葉片RNA的效果明顯較好(圖7).用紫外分光光度計(jì)分別檢測RNA提取樣品的A230、A260、A280及A260/A280與A260/A230比值,結(jié)果顯示,本文建立的方法與異硫氰酸胍法提取的RNA樣品純度都較高,沒有蛋白質(zhì)及多糖和酚類物質(zhì)的污染.但本方法RNA得率很大,每克材料可得232.2μg,是異硫氰酸胍法的3倍多(表1).另一方面,以硅藻土-苯酚法提取的RNA為模板,用麻瘋樹18SrRNA基因特異引物P1、P2做RT-PCR,能擴(kuò)增出預(yù)期長度為350bp的目的片段(圖8).這說明硅藻土-苯酚法提取的RNA完整性好,可以進(jìn)一步用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).2.6硅藻土-苯酚法的適用性為了考察本方法的適應(yīng)性,我們提取了富含RNase的動(dòng)物材料家兔肝臟,富含油脂與多酚的麻瘋樹種子、烏桕、銀杏、蘆薈的綠色葉片,灌漿期的玉米胚乳以及木霉等多種RNA提取困難的動(dòng)、植物及微生物材料(圖9),另外還提取了水稻幼苗、麻瘋樹幼葉、蓖麻樹幼葉等多種植物的RNA,都獲得了很好的效果.因此,硅藻土-苯酚法具有廣泛的適用性.2.7水稻小rna的富集和結(jié)構(gòu)分析在建立上述總RNA分離提取方法的基礎(chǔ)上,我們利用提取的水稻總RNA,通過高濃度LiCl及二步高濃度PEG-NaCl沉淀大片段RNA,試圖富集小RNA.1%非變性瓊脂糖凝膠電泳顯示,大片段RNA被有效地清除了,小RNA得到很好地富集(圖10),每克材料的得率為14.032μg.對(duì)所富集的水稻小RNA樣品,根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物,RT-PCR擴(kuò)增檢測是否存在Osa-miR156序列.電泳結(jié)果表明,擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期的條帶60bp左右相符(圖11).表明本方法提取的水稻小RNA含有miRNA等信息.3采用常規(guī)的提取方法來提取rnaRNA酶、多糖、多酚等物質(zhì)均是造成RNA難以成功提取的重要因素.RNA酶分為外源RNA酶和內(nèi)源RNA酶兩種,前者雖說無處不在,但是可以通過高溫干烘、RNA酶抑制劑(比如氯仿、DEPC水等)處理、勤換手套、帶口罩等方法加以解決,但內(nèi)源RNA酶來自樣品組織內(nèi)部,不能通過前期處理和小心預(yù)防的方法來清除,這就要求RNA提取過程中,抑制內(nèi)源RNA酶活性.依據(jù)硅藻土可以有效吸附RNA酶的特點(diǎn),我們?cè)谔崛【彌_液中引入了硅藻土,從而避免了樣品RNA被降解,結(jié)合酚仿抽提有效地去除了RNA酶等蛋白質(zhì),大大地提高了RNA提取的得率(表1).同時(shí),在提取過程中,采用高濃度的KAc和乙二醇丁醚沉淀等步驟,有效地去除了多糖多酚類物質(zhì),從而建立了有效提取樣品RNA的方案.實(shí)驗(yàn)中采用富含RNase的家兔肝臟,富含多糖的灌漿期玉米胚乳,富含多酚多油脂的銀杏葉片、麻瘋樹種子、蓖麻樹、烏桕樹、蘆薈葉片等植物材料,以及微生物材料木霉與酵母等提取RNA困難的材料中提取出了高質(zhì)量RNA,表明本方法具有廣泛的適用性.miRNA,siRNA等小RNA通過堿基互補(bǔ)的方式抑制或降解mRNA靶標(biāo),從而調(diào)控基因的表達(dá)水平,控制生物的多種發(fā)育途徑以及細(xì)胞凋亡和抵抗外來病原物的入侵等,并在臨床的基因診斷與治療上具有極大的應(yīng)用前景.有報(bào)道認(rèn)為基因組基因中至少有1/3的基因受miRNA的調(diào)控.分離純化小RNA是開展小RNA與基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系以及基因診斷和治療的前提.目前,小RNA的分離常用的方法是在分離總RNA的基礎(chǔ)上利用SDS回收.該方法路線程序多,步驟繁瑣復(fù)雜,且得率低.我們?cè)诮⒖俁NA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過LiCl與PEG8000加NaCl沉淀等步驟有效去除了大片段RNA