ghrelin對大鼠小腸轉(zhuǎn)運及c-fos表達的影響

ghrelin對大鼠小腸轉(zhuǎn)運及c-fos表達的影響

網(wǎng)絡(luò)發(fā)布時間：2014-07-221817。Ghrelin是生長激素促分泌素受體(growthhormonesecretagoguereceptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體,是由28個氨基酸組成的小分子多肽,在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布。Ghrelin受體的激活可發(fā)揮多種生理學(xué)作用,可刺激胃酸分泌和胃排空,加快小腸蠕動,改善術(shù)后腸梗阻癥狀。我們近來研究也發(fā)現(xiàn),ghrelin可促進大鼠消化間期復(fù)合肌電活動,但關(guān)于ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運的影響很少有研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)和腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)在胃腸運動中起著重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn),ghrelin可通過中樞和外周機制促進胃腸運動,然而關(guān)于其具體作用機制的研究很少見報道。新近研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射ghrelin導(dǎo)致大鼠攝食增加,下丘腦弓狀核、室旁核的c-Fos表達增加。腦室和室旁核注入ghrelin可促進大鼠攝食,增加與攝食相關(guān)核團,如下丘腦室旁核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、延髓孤束核和最后區(qū)的c-Fos表達。然而靜脈注射ghrelin還可以增加哪些腦區(qū)的c-Fos表達,是否可增加與促消化道動力相關(guān)的核團的c-Fos表達,是否能增加脊髓的c-Fos表達,目前尚不清楚。靜脈注射ghrelin對完整消化道c-Fos表達的影響尚未見報道。我們的實驗觀察了靜脈給予ghrelin對大鼠消化道和上述腦區(qū)c-Fos表達的影響,重點分析了與促消化道運動相關(guān)核團的c-Fos表達的變化,并觀察了受體拮抗劑對ghrelin作用的影響,為闡明并進一步研究ghrelin的促動力機制提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實驗動物成年健康SD大鼠,雌雄不拘,體質(zhì)量220~240g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.2大鼠rp-6和grtelinGhrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6由美國Anaspec公司提供,兔抗鼠c-Fos抗體由美國SantaCruz公司提供,Ghrelin由美國鳳凰生物制品有限公司提供。1.3小鼠腸轉(zhuǎn)染率的檢測①埋置十二指腸導(dǎo)管。大鼠禁食18h,腹腔注射100g/L水合氯醛400mg/kg麻醉,外科無菌操作下沿腹正中線剪開腹壁肌肉以及腹膜,用18G針頭在十二指腸距幽門1cm處刺入腸腔,將一根聚乙烯導(dǎo)管(外徑1.0mm,內(nèi)徑0.7mm)經(jīng)穿刺孔置入十二指腸腔內(nèi),導(dǎo)管在腸腔內(nèi)留置約1cm,用絲線將導(dǎo)管縫合固定。在右上腹和肩胛間區(qū)之間做皮下隧道,將導(dǎo)管固定于體外,以防鼠咬損壞。用大頭針封住導(dǎo)管的露出端。術(shù)后大鼠分籠單獨清潔飼養(yǎng),恢復(fù)1周可用于實驗。②小腸轉(zhuǎn)運的測量。實驗大鼠隨即分為5組(n=8),禁食24h,分別經(jīng)尾靜脈給予ghrelin(2、5、10、20μg/kg,溶于0.3mL生理鹽水)。對照組給予0.3mL生理鹽水。經(jīng)靜脈給予藥物或生理鹽水后,經(jīng)十二指腸導(dǎo)管注入0.1mL伊文氏藍溶液(50mg/mL溶于生理鹽水中)。用0.1mL生理鹽水沖洗導(dǎo)管,以保證導(dǎo)管內(nèi)的染料均進入十二指腸。20min后,脫頸椎處死大鼠,立即打開腹腔,用絲線扎緊幽門和回盲瓣,剪取上端自幽門、下端至回盲瓣的腸管。仔細分離腸系膜,將小腸擺放成直線。避免拉伸小腸,以防止腸內(nèi)容物流動。測量從幽門到回盲瓣的腸管長度為“小腸總長度”,從幽門至染料移行的前沿為“染料移行長度”,計算小腸轉(zhuǎn)運率(%)=[染料移行長度(cm)/小腸總長度(cm)]×100%。為觀察ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6在ghrelin促小腸轉(zhuǎn)運中的作用,經(jīng)尾靜脈給予(D-Lys3)GHRP-6(0.37mg/kg),10min后再給予ghrelin(20μg/kg),觀察小腸轉(zhuǎn)運變化,方法同上。1.4grt-pcr聯(lián)合grtp-6治療k-gh3-5e的藥物治療大鼠每組6只,分別經(jīng)頸靜脈注入ghrelin,生理鹽水,生理鹽水+ghrelin,(D-Lys3)GHRP-6+ghrelin。上述藥物劑量為ghrelin20μg/kg,ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-60.37mg/kg。注射藥物后大鼠禁食,自由飲水,90min后用100g/L水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)左心室穿刺至主動脈,用生理鹽水快速沖血管,用40g/L多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動脈灌注。開顱取腦和胸腰段脊髓,分別剪取胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、近端結(jié)腸和遠端結(jié)腸,生理鹽水沖凈,經(jīng)多聚甲醛緩沖液后固定8h,20~30g/L蔗糖溶液梯度脫水,液氮速凍后,組織包埋劑包埋,恒冷冰凍切片機切片。1.5c-fos抗體構(gòu)建采用SABC法進行c-Fos免疫組織化學(xué)染色。腦片采用漂染法,胃腸組織切片采用片染法。胃腸組織切片在PBS中浸泡5min,采用微波修復(fù)(高火3min,再小火10min),晾至室溫。腦片在PBS中浸泡5min,再和修復(fù)后的切片一起用稀鹽酸泡30min,以使細胞核形態(tài)清楚。PBS洗10min×3次,30mL/LTritonX-100室溫孵育40min,PBS漂洗5min×3次,30mL/LH2O2室溫孵育30min,PBS漂洗10min×3次。正常山羊血清封閉(37℃,90min),兔抗鼠c-Fos抗體孵育(1∶500,4℃42h)。PBS漂洗20min×3次,生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育(4℃18h),PBS漂洗20min×3次。ABC復(fù)合物孵育(37℃30min),PBS漂洗20min×3次,DAB顯色,PBS沖洗終止反應(yīng)。腦片進行裱片、晾干,再和胃腸組織切片一起脫水、透明、封片。用0.01mol/LPBS代替第一抗體做陰性對照。1.6c-fos陽性細胞計數(shù)共選取14個中樞核團或亞核進行分析,其中包括GHS-R分布較多的部位以及對消化道功能有重要調(diào)控作用的核團。對每只大鼠每個核團的c-Fos陽性細胞記數(shù)時,必須在相同平面選擇6張腦片,胸腰段脊髓選取20張脊髓片計數(shù),在高倍鏡下結(jié)合Paxinos-Waston圖譜分別數(shù)兩側(cè)核團,算出平均值(在室旁核給藥時數(shù)一側(cè)室旁核)。胃腸道c-Fos陽性細胞的記數(shù)采用每只大鼠選取6張切片,每張切片在高倍鏡下隨機數(shù)5個視野,算出平均值。1.7方差分析結(jié)果結(jié)果采用ue0af±s表示,統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗及單因素方差分析(SPSS13.0軟件),組間比較采用LSD-t檢驗,數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗,方差齊同,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1[小鼠轉(zhuǎn)運率]對照組大鼠小腸轉(zhuǎn)運率為(62.7±6.2)%。與對照組相比,靜脈給予ghrelin2μg/kg時小腸轉(zhuǎn)運率無統(tǒng)計學(xué)差異[(70.2±6.4)%,P>0.05],給予ghrelin5μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運率(73.7±7.1)%,P<0.05],10μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運率為(75.5±6.9)%,P<0.01]和20μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運率為(80.9±8.5)%,P<0.001]呈劑量依賴性地促進小腸轉(zhuǎn)運。Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6單獨應(yīng)用對小腸轉(zhuǎn)運有抑制作用[小腸轉(zhuǎn)運率為(52.6±7.6)%,P<0.05],與ghrelin聯(lián)合應(yīng)用則顯著阻斷了其促動力作用[轉(zhuǎn)運率為(65.7±7.2)%,P<0.05,圖1]。2.2c.n-pcr中pahs-mtn-medalus,u-pas,cornu-solitact,spinlus,dcmsc-Fos的免疫反應(yīng)陽性為胞核呈黃色或深棕色,胞質(zhì)無表達。我們的研究發(fā)現(xiàn),生理鹽水對照組大鼠的c-Fos表達很少,而給大鼠靜脈注射ghrelin后可誘導(dǎo)CNS內(nèi)廣泛部位的c-Fos表達,最突出的部位是下丘腦室旁核(periventricularnucleus,PVN)、弓狀核(arcuatenucleus,ARC)、杏仁內(nèi)側(cè)核(medialamygdaloidnucleus,Me)、迷走神經(jīng)背核(dorsalmotornucleusofvagus,DMN)、孤束核(nucleusofsolitarytract,NTS)、延髓最后區(qū)(areapostrema,AP)及胸腰段脊髓背角(cornudorsalemedullaespinalis,CDMS)(圖2、圖3)。然而,下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedialhypothalamicnucleus,VMH)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(dorsomedialhypothalamicnucleus,DMH)、外側(cè)區(qū)(lateralhypothalamicarea,LH)、海馬(hippocamp,HIP)、杏仁中央核(centralamygdaloidnucleus,CeA)、杏仁基底外側(cè)核(basolateralnucleusoftheamygdala,BL)及腦橋臂旁核(parabrachialnucleus,PBN)均未見表達。2.3射grtelin單次給藥對大鼠胃、瞳金叢c-fos表達的影響鹽水對照組大鼠的胃腸道腸神經(jīng)叢c-Fos表達很少,甚至沒有表達。靜脈注射ghrelin不同程度地增加了大鼠胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸的腸神經(jīng)叢的c-Fos表達,其中以胃和近端結(jié)腸的c-Fos表達最為顯著(圖4、圖5)?；啬c、盲腸和遠端結(jié)腸的c-Fos表達與對照組相比無顯著差異。2.4grt-pcr中c-fos的表達核團靜脈給予ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6后再給予ghrelin,觀察腦內(nèi)各核團的c-Fos表達的變化。實驗所選取的核團為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達增加的核團,包括下丘腦室旁核、弓狀核、迷走神經(jīng)背核,孤束核、延髓最后區(qū),胸腰段脊髓背角、杏仁內(nèi)側(cè)核。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的中樞各核團c-Fos的表達,即c-Fos表達明顯減少(表1)。2.5腸神經(jīng)叢的選擇靜脈給予(D-Lys3)GHRP-6后再給予ghrelin,觀察腸神經(jīng)叢的c-Fos表達的變化。實驗選取的腸神經(jīng)叢為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達增加的腸神經(jīng)叢,包括胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的胃腸神經(jīng)叢c-Fos表達,即c-Fos表達均明顯減少(表2)。3grtelin調(diào)控腸道c-fos基因Ghrelin作為新近發(fā)現(xiàn)的腦腸肽,其生理作用及其機制也越來越受到重視。新近研究發(fā)現(xiàn),ghrelin可加速胃排空、增加胃酸分泌及促進結(jié)腸運動。目前,關(guān)于ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運的影響很少有研究。FUKUDA等通過觀察ghrelin對大鼠胃排空和小腸轉(zhuǎn)運的影響,提出ghrelin可能通過內(nèi)在的神經(jīng)通路和對辣椒辣素敏感的感覺傳入神經(jīng)系統(tǒng)促進胃腸運動,但沒有研究量效關(guān)系和ghrelin受體拮抗劑的作用。并且FUKUDA等采用將Na51CrO4灌入大鼠胃中的方法來觀察小腸轉(zhuǎn)運,這受到胃排空的影響,并不是單獨的小腸轉(zhuǎn)運。我們的實驗通過在大鼠十二指腸埋置導(dǎo)管,經(jīng)導(dǎo)管注入伊文氏藍來觀察ghrelin對小腸轉(zhuǎn)運的影響,并建立量效曲線,觀察了ghrelin受體拮抗劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),靜脈注射ghrelin可促進大鼠小腸轉(zhuǎn)運,并呈劑量依賴性關(guān)系,ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6顯著阻斷ghrelin的促動力作用。BRON等通過原位雜交等方法證實ghrelin受體GHS-R存在于大鼠的下丘腦、延髓、心臟、胃腸道等處。DASS和XU等利用熒光免疫組織化學(xué)方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結(jié)腸也發(fā)現(xiàn)ghrelin及其受體。然而,ghrelin調(diào)控胃腸運動的具體機制尚不明確,研究其對神經(jīng)元的作用則十分必要。C-Fos基因是一種即刻早期基因,被稱為核內(nèi)“第三信使”。在生理情況下,大多數(shù)細胞中有很低水平的c-Fos表達。在藥物、電刺激及缺血等情況下,c-Fos表達可在數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘內(nèi)顯著增多。因此,c-Fos的表達可作為神經(jīng)元受刺激后激活的標(biāo)志。MASUDA等發(fā)現(xiàn)靜脈注射ghrelin0.8~20μg/kg可刺激胃酸分泌和胃排空。FUJINO等證實靜脈注射ghrelin4~40μg/kg均可促進禁食期間的胃腸動力。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn),ghrelin20μg/kg可顯著增強消化間期胃腸的肌電活動。因此,本實驗選定20μg/kg為觀察ghrelin對胃腸道c-Fos表達變化的靜脈給藥量,認為其為促進胃腸動力的有效劑量。實驗結(jié)果顯示,靜脈注射ghrelin可增加下丘腦室旁核、弓狀核和杏仁內(nèi)側(cè)核的c-Fos表達,同時增加迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體(dorsalvagalcomplex,DVC)(包括迷走神經(jīng)背核、孤束核及最后區(qū))、胸腰段脊髓背角的c-Fos表達;臂旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核及海馬等處的c-Fos表達也有增加,但與對照組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異。應(yīng)用ghrelin受體拮抗劑顯著減弱了ghrelin的作用。然而,RUTER等研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射ghrelin不能增加DVC的c-Fos表達。我們的研究與此有差異,這可能是由于靜脈和腹腔兩種給藥途徑不同所致,或由于尚不明確的其他因素(如給藥劑量不同或大鼠種屬不同)。下丘腦和腦干是調(diào)節(jié)機體功能的兩個重要結(jié)構(gòu)。下丘腦與其他腦區(qū)有復(fù)雜而廣泛的纖維聯(lián)系,它不僅通過神經(jīng)和血管途徑調(diào)節(jié)腦垂體前、后葉激素的分泌和釋放,而且還參與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng),如控制水鹽代謝、調(diào)節(jié)體溫、攝食、睡眠等內(nèi)臟活動以及情緒等。已有研究證實下丘腦的弓狀核和室旁核參與CNS對胃腸道功能的調(diào)節(jié)。腦干的主要功能是維持個體生命,包括心跳、呼吸、消化、體溫、睡眠等重要生理功能。腦干與下丘腦有密切聯(lián)系,腦干的孤束核神經(jīng)元可發(fā)出纖維直接投射到達下丘腦,同時也可接受下丘腦的下行投射。腦干的DVC,可將來自脊髓的神經(jīng)沖動傳至大腦,是腦腸軸的中樞整合部位。本研究發(fā)現(xiàn),靜脈注射ghrelin使下丘腦核團和腦干DVC的c-Fos表達增加,提示下丘腦核團參與了ghrelin的生物學(xué)作用,腦干參與ghrelin的信息傳遞。然而,c-Fos陽性細胞在一些核團的分布與GHS-R的分布并不完全一致。例如,在下丘腦外側(cè)區(qū)、海馬CA3和CA4區(qū)和杏仁基底內(nèi)側(cè)核的GHS-R分布很豐富,但卻缺乏c-Fos表達。我們推測ghrelin對這些核團c-Fos的激活可能需要其他因子的參與(至少對c-Fos來說),或者通過除GHS-R之外的受體發(fā)揮其功能。靜脈注射ghrelin使下丘腦室旁核和弓狀核的cFos表達顯著增多。以往研究表明,GHS-R在室旁核和弓狀核上均有廣泛表達,ghrlein在弓狀核也有較多表達。弓狀核是表達許多攝食相關(guān)神經(jīng)肽的感受器,如瘦素及ghrelin。弓狀核神經(jīng)纖維聯(lián)系十分廣泛,與室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、孤束核等都有豐富的纖維投射,除了在攝食調(diào)節(jié)和能量平衡中起重要作用外,還直接參加消化道運動功能的調(diào)節(jié)。室旁核接受來自弓狀核的神經(jīng)纖維,兩者共同參與中樞對攝食、能量代謝、胃腸活動等的調(diào)控。由于弓狀核位于血腦屏障之外,可以直接接受來自外周的傳入信號,我們推測靜脈注射的ghrelin還有可能直接作用于弓狀核上的GHS-R,