溫敏性殼聚糖水凝膠材料的制備及細(xì)胞相容性研究

溫敏性殼聚糖水凝膠材料的制備及細(xì)胞相容性研究

1殼聚糖水凝膠在心血管疾病治療中的應(yīng)用干預(yù)性心臟疾病的發(fā)病率和死亡率很高。臨床上治療晚期缺血性心臟疾病的主要方法是進(jìn)行心臟移植,但該方法受到供體來源的限制。近年的研究表明,單純細(xì)胞移植治療雖可提高受損心臟功能,但在移植過程中細(xì)胞滯留率和存活率低,導(dǎo)致長(zhǎng)期治療效果不明顯。組織工程學(xué)的誕生為缺血性心臟疾病的治療帶來了希望,尤其是近年可注射性水凝膠生物材料研制不斷取得突破,為可注射性組織工程化心肌的研制及心臟疾病的治療奠定了基礎(chǔ)?？勺⑸湫运z材料是攜帶細(xì)胞的載體,起著攜帶細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)移植區(qū)滯留及增殖與分化的作用,是可注射性組織工程化心肌研制的重要組成部分。以往用于治療缺血性心臟疾病的可注射性材料主要包括纖維蛋白膠和Matrigel膠等,但這些材料在心梗部位移植后降解過快,影響了治療效果。殼聚糖水凝膠是應(yīng)用多元醇甘油磷酸鈉中和殼聚糖溶液后得到的溫敏性材料,它具有生物相容性好、體內(nèi)降解時(shí)間及凝固時(shí)間可調(diào)節(jié)控制等優(yōu)點(diǎn),在軟骨組織工程等領(lǐng)域已經(jīng)得到應(yīng)用。但對(duì)于這種材料的研制方法及與細(xì)胞粘附、支持生長(zhǎng)等方面的研究較少。因此,我們對(duì)以氯化殼聚糖和β-甘油磷酸鈉為原料制備的可注射的殼聚糖水凝膠,進(jìn)行了系統(tǒng)的理化特性分析以及和C2C12細(xì)胞的粘附、支持作用等方面的研究,為可注射性心肌組織工程的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2材料和方法2.1材料表面2.1.1抗氧化酶siga氯化殼聚糖(Protasan-UP213,挪威,脫乙酰度86%,鹽酸含量14%);β-甘油磷酸鈉(Sigma,美國);胰蛋白酶(Sigma,美國);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)(每升中含NaHCO33.7g,HEPES2.4g,青霉素、鏈霉素各10萬單位);胎牛血清(MDgenicsInC,美國);其余常規(guī)試劑均為分析純?cè)噭?.1.2克氏原螯蝦4-5CO2孵箱(美國);旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)VISCOSTARPlus(西班牙);OLYMPUS顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本);LEICA切片機(jī)(德國);LEICA倒置相差顯微鏡(德國);YJ-875型超凈工作臺(tái)(哈東聯(lián));PH211型pH計(jì)(意大利)。2.1.3細(xì)胞成像c1c12C2C12細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。2.2方法2.2.1em培養(yǎng)基氯化殼聚糖(C)0.2g紫外線照射滅菌,溶于10mlDMEM培養(yǎng)基中,配制為2%C-DMEM溶液,4℃冰箱備用。β-甘油磷酸鈉(GP)4.5g溶解于10ml的DMEM培養(yǎng)基,配制為45%GP-DMEM溶液,0.22μm過濾除菌,4℃冰箱備用。2.2.2地殼聚糖溶液的ph值的測(cè)定用pH試紙分別測(cè)定4℃、室溫和37℃時(shí),2%C-DMEM溶液的pH值。2.2.3材料準(zhǔn)備將2%C-DMEM溶液和45%GP-DMEM溶液以4:1的比例在冰盒上充分混合,然后置于37℃,15min后即變?yōu)楣虘B(tài)凝膠。2.2.4溶液粘度測(cè)定使用VISCOSTARLCP型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì),在0min、3min、7min3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定2%C-DMEM溶液的粘度,以及2%C-DMEM和45%GP-DMEM溶液以4:1的比例混勻后溶液的粘度。2.2.5添加其他gp-dmem溶液配制1%、2%、3%、4%、5%C-DMEM系列溶液,在上述系列溶液中分別按比例加入45%GP-DMEM溶液。充分混勻溶液后轉(zhuǎn)移到10ml的離心管,37℃孵箱放置,每隔5min觀察混合溶液的相轉(zhuǎn)變行為,以離心管倒置時(shí)溶液不再流動(dòng)判定是否成膠。2.2.6水凝膠的顯微觀察將配制好的殼聚糖水凝膠混合溶液置于24孔板中,37℃放置15min后變成固態(tài)水凝膠,然后在顯微鏡下觀察。將材料進(jìn)行冰凍切片,分別進(jìn)行HE染色和Masson三色染色,觀察其結(jié)構(gòu)。2.2.7殼聚糖水凝膠對(duì)c2c12細(xì)胞的吸附能力將已經(jīng)制備好的殼聚糖溶液以每孔300μl的量注入12孔板中,37℃交聯(lián)作用15min,當(dāng)混合液成為固態(tài)凝膠狀鋪于孔板底部時(shí),每孔接種105個(gè)C2C12細(xì)胞,并加入培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。1h后在顯微鏡下隨機(jī)選擇細(xì)胞均勻分布的5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)殼聚糖水凝膠對(duì)C2C12細(xì)胞的吸附能力。而后每天在顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。3結(jié)果3.1殼聚糖水凝膠的制備在冰盒上混勻的液態(tài)凝膠為無色透明的液體,并且在室溫條件下長(zhǎng)時(shí)間保持液態(tài),37℃時(shí)短時(shí)間內(nèi)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),變?yōu)楣虘B(tài)膠凍樣凝膠。3.2皮聚糖溶液的ph值4℃測(cè)定結(jié)果:2%C-DMEM溶液的pH值為6.9,在室溫和37℃時(shí)pH值不發(fā)生變化,即殼聚糖溶液的pH值不隨溫度升高發(fā)生改變。3.3混合的濃度3.2%c-dmem和45%gp-dmem溶液b液室溫下2%C-DMEM溶液(A液)的粘度為211.14CP;2%C-DMEM和45%GP-DMEM溶液(B液)以4:1的比例混合3min后,粘度增加。旋轉(zhuǎn)器攪拌7min后,達(dá)到粘度計(jì)的最大測(cè)量值2000CP(見表1)。3.43成膠時(shí)間的確定37℃孵箱中,不同濃度的C-DMEM溶液與45%GP-DMEM溶液以4:1的比例充分混勻后,成膠時(shí)間不同,見表2。其中當(dāng)C-DMEM溶液的濃度為2%時(shí),成膠時(shí)間最短,為15min。3.5mahens型殼聚糖水凝膠大體觀察為乳白色膠凍狀,HE染色可見顆粒大小均勻的嗜紅著色,顆粒與顆粒之間有紅染著色的絲狀相連,形成大小均一、形狀不規(guī)則的網(wǎng)格樣平面(見圖1A);Masson三色染色為深淺不一的紅色,中間嵌有許多空洞樣圓圈(見圖1B);未染色的材料在顯微鏡下觀察,可見水凝膠質(zhì)地均勻,表面為顆粒樣或者為孔隙樣物質(zhì)(見圖1C)。3.6圓形細(xì)胞的生長(zhǎng)C2C12細(xì)胞在殼聚糖水凝膠表面復(fù)合1h后尚未伸展,可以觀察到圓形細(xì)胞緊貼在材料表面(見圖2A),而后可觀察到細(xì)胞在殼聚糖水凝膠中生長(zhǎng)狀態(tài)良好;培養(yǎng)3d后細(xì)胞開始生長(zhǎng),培養(yǎng)5d后細(xì)胞基本鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)皿底面(見圖2B)。4殼聚糖水凝膠的作用及其機(jī)制心肌梗塞是心臟病死亡的主要原因,由于心梗發(fā)生后心肌不能再生,無收縮功能的纖維結(jié)締組織會(huì)逐漸代替死亡的心肌,最終導(dǎo)致心功能衰竭。心肌梗死區(qū)局部移植治療是心臟缺血性疾病的一種有前景的治療方法之一,近年來取得了明顯進(jìn)展。各種來源的細(xì)胞,如心肌細(xì)胞、骨骼成肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及小鼠和人胚胎干細(xì)胞等均已經(jīng)被用于心肌缺血疾病的移植治療。研究表明,這些細(xì)胞可以減輕纖維結(jié)締組織增生程度,促進(jìn)新生血管生成,阻止心室壁進(jìn)一步重構(gòu),從而改善心臟功能。但是細(xì)胞局部移植治療的方法存在明顯的限制性因素,如移植區(qū)細(xì)胞的低滯留率和低存活率等。因此,如何提高細(xì)胞攜帶能力以及局部注射后存活率是細(xì)胞移植治療中的關(guān)鍵問題。為了提高細(xì)胞攜帶能力以及局部注射后細(xì)胞的存活率,通過可注射性生物材料攜帶細(xì)胞的方式,可為細(xì)胞運(yùn)輸和細(xì)胞心梗部位存活提供三維空間,材料發(fā)揮了細(xì)胞外基質(zhì)功能,進(jìn)而提高細(xì)胞的運(yùn)輸率及體內(nèi)的存活率。但現(xiàn)在常用的纖維蛋白膠和Matrigel膠等材料均存在降解時(shí)間過快,細(xì)胞滯留率低等缺點(diǎn)。殼聚糖是一種天然生物多糖,可以和離子、聚合物以多種方式復(fù)合,形成溫敏性凝膠或光敏性凝膠等。已有研究者將光敏殼聚糖水凝膠應(yīng)用到心肌缺血的實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),殼聚糖水凝膠可以明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活、誘導(dǎo)新生血管生成、改善心臟功能。研究表明,溫敏性殼聚糖水凝膠具有良好的組織相容性、對(duì)攜帶的藥物、因子或細(xì)胞具有控制釋放的作用。但對(duì)于溫敏性殼聚糖水凝膠的各種理化性質(zhì)的研究報(bào)道較少。因此,我們?cè)谶@方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,我們選用的氯化殼聚糖的脫乙酰度為86%,通過對(duì)其溶解性和酸堿度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),氯化殼聚糖在DMEM溶液的溶解性良好,與正常細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境更加接近。通過測(cè)定37℃時(shí)凝膠作用的時(shí)間,我們進(jìn)一步證實(shí),2%的溶液比3%的溶液制備凝膠的時(shí)間要快10min,因此,我們選用2%的殼聚糖溶液和45%的β-甘油磷酸鈉溶液制備的殼聚糖水凝膠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。顯微鏡下觀察制備的殼聚糖水凝膠,發(fā)現(xiàn)它由許多細(xì)小顆粒整齊地平鋪而成,顆粒與顆粒之間有無數(shù)空隙。HE染色和Masson三色染色發(fā)