阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒的研制

阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒的研制實(shí)習(xí)生 韓勇指導(dǎo)老師 陳鷹

摘要目的：制備穩(wěn)定性好，親和力強(qiáng)的阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒。方法：采用均勻設(shè)計(jì)等方法篩選處方和工藝。先制備阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，再將其用磷脂雙分子層包裹，得到阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒。結(jié)果：制得的復(fù)合磷脂毫微粒的平均包封率為86.65%±0.97，平均粒徑為256.2nm。穩(wěn)定性較普通脂質(zhì)體要好，包封率比普通毫微粒要大。結(jié)論：阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒達(dá)到設(shè)計(jì)要求，該制劑有望成為一種新的藥物靶向載體系統(tǒng)。關(guān)鍵詞阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒均勻設(shè)計(jì)法包封率穩(wěn)定性

STUDIESOFADRIAMYCINCOMPOUNDLIPOSOMALNANOPARTICLESHanYong*ChenYing(WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,*StudentonGraduate’2000inthePharmacyCollegeofHuazhongScienceandTechnologyUniversity)AbstractObjective:ToprepareAdriamycinCompoundLiposomalNanoparticleswithgoodstabilityandstrongaffinity.Methods:Usingevendesignmethodtooptimizetherecipeandtechnology.Atfirst,AdriamycinPolybutylcyanoacrylatenanoparticleswasprepared.ThenAdriamycinCompoundLiposomalNanoparticles.Results:TheaverageenvelopingrateofthepreparedCompoundLiposomalNanoparticlesis86.65%±0.97(n=3),theaverageparticlesizeis256.2nm.Thestabilityisbetterthanthatofcommonliposomes.Theenvelopingrateislargerthanthatofcommonnanoparcles.Conclusions:AdriamycinCompoundLiposomalNanoparticlesisconsistentwiththedesigningsupposition.Thispreparationisexpectedtobecomeanewdrugtargetingcarriersystem.Keywords:AdriamycinCompoundLiposomalNanoparticlesEven-designmethodEnvelopingrateStability

毫微粒（Nanoparticles，NP）系利用天然高分子或合成的化學(xué)物質(zhì)為載體制成的載藥微粒[1]。其活性成分溶解、包封、吸附或連接在載體粒子上形成帶乳光的膠體分散系統(tǒng)，粒子大小在10-1000nm之間，具有緩釋性，穩(wěn)定性較好，可生物降解性和一定的生物組織靶向性及負(fù)載量大等特點(diǎn)，是一種良好的抗癌藥物載體，但作為NP的材料中的某些聚合物對(duì)人體有一定抗原性，而且有的并非藥用輔料，進(jìn)入人體可能會(huì)產(chǎn)生不良影響。 脂質(zhì)體（Liposome）是將藥物包封于類(lèi)脂雙分子層形成的薄膜中間所制成的超微型球狀載體制劑。具有組織親和力強(qiáng)、可生物降解、無(wú)毒性及靶向性等特點(diǎn)。但脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，進(jìn)入人體后因血中酶及蛋白的作用易破裂使藥物漏出，又易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別吞噬，縮短藥物在體內(nèi)的停留時(shí)間而降低療效。 阿霉素（Adriamycin,ADM）作為目前肝癌化療的首選藥物之一，臨床上直接用于病人對(duì)其心臟及造血系統(tǒng)等毒性大，國(guó)內(nèi)外已有不少人將其制成單獨(dú)的脂質(zhì)體或毫微粒以增強(qiáng)其定向輸送，減小用藥量和毒副作用。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，考慮到NP具有緩釋性、穩(wěn)定性好，以及脂質(zhì)體具有親和力強(qiáng)、無(wú)毒性的優(yōu)點(diǎn)，為此，我們將兩者結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行了如下的探索性研究，即首先制備阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，再將其用磷脂雙分子層包裹，最后得到兼具兩者優(yōu)勢(shì)的阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒，該制劑有可能成為一種新的藥物靶向載體系統(tǒng)。1．

藥品與儀器1．

1藥品：鹽酸阿霉素（原料藥，深圳萬(wàn)樂(lè)制藥有限公司,批號(hào):xc-044），膽固醇（北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠），磷脂（進(jìn)口分裝，注射用），α-氰基丙烯酸正丁酯，磷酸緩沖液（PBS，PH＝5.0），SephadexG-50（上海腦海生物科技公司），右旋糖酐70、吐溫-80為藥用規(guī)格，乙醚、二甲基亞砜（DMSO）等試劑為分析純。2．

2儀器：DF-101B型集熱式恒溫磁力攪拌器（浙江樂(lè)清市樂(lè)成電器廠）,RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）,SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪儀器廠）,KT-300Y型超聲波藥品處理機(jī)（濟(jì)寧中冠超聲波有限責(zé)任公司）,JY92-2D型超聲波探頭式粉碎機(jī)（寧波新芝科技研究所）,電鏡（HITACHIH-300）,UV-260紫外分光光度計(jì)（日本島津）,電光分析天平（上海天平儀器廠）。1．

方法與結(jié)果2．1處方篩選與制備2．1．1阿霉素毫微粒（產(chǎn)品A）的制備： 因產(chǎn)品A的制備方法及配方無(wú)詳細(xì)報(bào)道，故只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果并參考有關(guān)文獻(xiàn)[2]，采用均勻設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)圖表，見(jiàn)表1,按U9（94）安排試驗(yàn)，見(jiàn)表2。表1 因素與水平水平因素X1X2X3X4(mg)1a50%32a5.50.2%43a5.50.4%54b60.6%75b6.50.8%96b71.0%127c7.51.2%158c81.5%179c8.52%25其中X1為制備方法：a法：在磁力攪拌下，將含右旋糖酐、吐溫、ADM并調(diào)節(jié)PH值的10ml水溶液注入到PBCA中，繼續(xù)攪拌2hr，過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。b法：將ADM和PBCA溶于丙酮－甲醇－三乙胺（4：3：1）混合溶劑中，磁力攪拌下，用細(xì)針頭注入含Tween－80和右旋糖酐的10ml水中,攪拌2hr，再用真空水泵抽去有機(jī)溶劑，過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。c法：在磁力攪拌下，將PBCA注入到含右旋糖酐、吐溫、ADM并調(diào)節(jié)PH值的10ml水溶液中,繼續(xù)攪拌2hr，過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。X2為PH值，X3為穩(wěn)定劑右旋糖酐用量，X4為ADM的量（mg）。表2 試驗(yàn)方案與結(jié)果試驗(yàn)號(hào)因素YX1X2X3X4(mg)11(a)2(5.5)4(0.6%)7(15)25.0322(a)4(6)8(1.5%)5(9)20.7433(a)6(7)3(0.4%)3(5)13.7844(b)8(8)7(1.2%)1(3)3.4955(b)1(5)2(0.2%)8(17)24.7366(b)3(5.5)6(1.0%)6(12)20.7277(c)5(6.5)1(0%)4(7)9.9188(c)7(7.5)5(0.8%)2(4)3.1199(c)9(8.5)9(2%)9(25)0.61 將均勻設(shè)計(jì)各次實(shí)驗(yàn)所得樣品進(jìn)行包封率（ER）測(cè)定，電鏡觀察外觀（AP）及粒徑大?。≒D）計(jì)算，以PD、AP（滿(mǎn)分值各為10分）和ER（實(shí)際計(jì)算百分值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按下式進(jìn)行綜合評(píng)分，Y＝AP+PD+ER/10，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。另設(shè)a=1，b=2，c=3，在微機(jī)上經(jīng)SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件多元逐步回歸分析，得回歸方程：y=60.3352-3.6812x1-6.2518x2+0.1775x4,n=9，s=5.2017，r=0.9219，F(xiàn)=7.82>F0.1(4,3)=5.34。根據(jù)回歸分析：x1和x2系數(shù)為負(fù)，宜取下限值，x4系數(shù)為正，表明其取值宜大。x3與Y間相關(guān)性差，在逐步回歸分析時(shí)被去除，表明在所取值范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果影響不大。最后，經(jīng)綜合考察，制備ADM-PBCA的優(yōu)化條件為：x1=a,x2=5,x3=1.5%,x4=10。并將各取值代入方程得Y=27.17,與實(shí)測(cè)值27.01相近。另外,參考文獻(xiàn)[3,4]對(duì)其他因素進(jìn)行考察，溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，室溫即可。攪拌速度對(duì)粒徑影響不很大，攪拌時(shí)間為2hr。Tween-80作為表面活性劑可促進(jìn)制劑的物理穩(wěn)定性。無(wú)水Na2SO4是常用的沉淀劑,但Na2SO4的加入可致凝聚過(guò)快，微粒成團(tuán)出現(xiàn)，本系統(tǒng)中水本身可作為成囊過(guò)程的引發(fā)劑，故不采用Na2SO4。最后，我們?cè)O(shè)計(jì)了制備工藝如下：取PBCA0.3ml于干燥小燒杯中，另一小燒杯中加入10mgADM，2.5ml6%右旋糖酐，3滴吐溫-80，適量水并用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH＝5.0，使成均勻液10ml，在磁力攪拌下，將上述溶液用細(xì)針頭緩緩注入PBCA中，連續(xù)攪拌2hr，過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。2．1．2阿霉素復(fù)合磷脂毫微粒（產(chǎn)品B）的制備 根據(jù)”2．1．1項(xiàng)下”的篩選，我們得到了粒徑小，包封率較高的產(chǎn)品A，下一步，我們采用磷脂材料對(duì)產(chǎn)品A進(jìn)行包裹，并對(duì)制備方法及影響因素進(jìn)行了探討。2．1．2．1制備方法的影響 按照常規(guī)的脂質(zhì)體制備方法[5]，將上述得到的阿霉素毫微粒（產(chǎn)品A）制備成脂質(zhì)體。方法1（干膜法）：取溶有大豆磷脂180mg與膽固醇100mg的乙醚混合液10ml，置于圓底燒瓶中，在真空水泵上抽干成一均勻脂膜,加入制好的產(chǎn)品A液10ml溶脹30min后，水浴超聲（1min1次，共2次）至成懸濁液，然后將懸濁液再在探頭式超聲處理機(jī)上處理（60s一次,共10次，每次間隔10s），并過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子后,即得。方法2（逆相蒸發(fā)法）：將大豆磷脂180mg，膽固醇100mg溶于30ml乙醚中，加入上述制好的產(chǎn)品A液10ml，進(jìn)行短時(shí)超聲，直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。然后減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，滴加PBS緩沖液（PH＝5.0）5ml，旋轉(zhuǎn)幫助器壁上的凝膠脫落，然后在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，制得水性混懸液,并過(guò)0.45μm濾膜除去大粒徑粒子后即得。比較法1和法2的產(chǎn)品，法1得到的平均粒徑為256.2nm，法2得到平均粒徑為2185.1nm，前者小于后者，且后者穩(wěn)定性比前者差。2．1．2．2膜材的用量 從以上結(jié)果來(lái)看，我們采用法1（干膜法）制備產(chǎn)品B，對(duì)卵磷脂/膽固醇的配比用量，我們?cè)囘^(guò)四種比例（100mg/100mg；180mg/100mg；200mg/200mg；300mg/100mg），從包封率和粒徑方面考慮，以卵磷脂（180mg）/膽固醇（100mg）的配比為最佳。2．1．3阿霉素脂質(zhì)體的制備（產(chǎn)品C） 方法同“2．1．2．1項(xiàng)下”的方法1，并將A液換成ADM溶液，即得。2．2質(zhì)量研究2．2．1形態(tài)觀察 三種產(chǎn)品外觀均為磚紅色均勻乳狀液，分別將產(chǎn)品A、B、C，直接或用2％磷鎢酸負(fù)染后，電子顯微鏡下觀察形態(tài)，可以看到：A為大小均勻規(guī)則的圓球形,表面平滑完整；B為較為均勻的圓球形或橢圓形小體，小體中較為清晰的分為兩層；C為近圓球形小體，呈單層膜結(jié)構(gòu)。見(jiàn)附圖1。2．2．2粒徑測(cè)定 用透射電鏡（100粒計(jì)）拍攝照片，用測(cè)微尺對(duì)100個(gè)小體測(cè)定，得到：A平均粒徑為：230.7nm,范圍：100.0nm-425.0nm；B平均粒徑為：256.2nm，范圍：195.0nm-395.0nm；C平均粒徑為：285.0nm，范圍：140.0nm-416.0nm。2．2．3含量測(cè)定2．2．3．1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以水為溶劑，對(duì)ADM的吸收在200-600nm范圍內(nèi)進(jìn)行了掃描（附圖2），精密稱(chēng)定ADM標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，置100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，再分別精密吸取上述溶液2ml，5ml，6ml，7ml，10ml，分別置25ml容量瓶中并稀釋至刻度，制成濃度為8.16ug/ml，20.40μg/ml，24.48μg/ml，28.56μg/ml，40.80μg/ml的濃度系列，在479.0±1nm處測(cè)定上述溶液的吸收度A，以A對(duì)濃度C作線性曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線一：A＝0.022165＋0.020639C（r=0.9999）,ADM水溶液在8μg/ml-40μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 以DMSO為溶劑，分別對(duì)ADM（見(jiàn)附圖3），膽固醇十卵磷脂（見(jiàn)附圖4）以及PBCA（見(jiàn)附圖5）的吸收在200-600nm范圍內(nèi)進(jìn)行了掃描。從掃描圖上看，基質(zhì)膽固醇十卵磷脂和PBCA在紫外光區(qū)的吸收會(huì)對(duì)ADM吸收產(chǎn)生干擾，故采用波長(zhǎng)479.0±1nm處繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以DMSO為溶劑，配制了濃度為7.60μg/ml，11.40μg/ml，19.00μg/ml，22.80μg/ml，26.60μg/ml，30.40μg/ml，38.00μg/ml的ADM的濃度系列，在479.0±1nm處測(cè)定上述溶液的吸收度A，以A對(duì)濃度C作線性曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線二：A＝-0.012625＋0.019893C（r=0.9999）,ADM的DMSO溶液在8μg/ml-40μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2．2．3．2回收率和精密度試驗(yàn) 取15份空白磷脂毫微粒各1ml，分成3組，每組5份，每組分別加入濃度a：19.00μg/ml，b:26.60μg/ml，c:38.00μg/ml的ADM的DMSO溶液5ml，并用DMSO溶解定容為10ml，在479.0±1nm處測(cè)吸收度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線二中計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法回收率和精密度編號(hào)分組加入量(μg)測(cè)出量(μg)回收率(%)平均回收率(%)精密度(%)a1

96.74101.83

2

96.50101.58

395.0094.7999.78100.651.064

95.64100.67

5

94.4499.41

b1

133.59100.44

2

134.91101.44

3133.00134.47101.11100.400.914

131.9599.21

5

132.7599.81

c1

191.91101.01

2

188.4299.17

3190.00190.68100.36100.580.894

192.94101.55

5

191.57100.83

2．2．3．3樣品測(cè)定 將產(chǎn)品A（或B或C）1ml，加入DMSO稀釋至100ml，在479.0±1nm處測(cè)A值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線二中，測(cè)得每毫升產(chǎn)品A（或B或C）中的ADM總量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4各產(chǎn)品每毫升含藥總量（μg） 產(chǎn)品吸收度A每毫升含藥總量（μg）A0.1951043.0B0.183983.0C0.180968.02．2．4包封率測(cè)定2．2．4．1柱分離回收率 取空白復(fù)合磷脂毫微粒1ml，分別加入濃度為20.40μg/ml，28.56μg/ml和40.80μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)ADM水溶液5ml，混勻后，取1ml加于柱頂端，按“2．2．4．3項(xiàng)下”測(cè)定全部洗脫液中ADM總量，與已知的上柱ADM量相比，即得平均柱分離回收率為99.70％±0.65，RSD為0.98％。2．2．4．2柱分離曲線 精密吸取產(chǎn)品A（或B或C）1ml，上SephadexG-50柱（Φ1.2×25cm），用PH＝5.0的PBS緩沖液為洗脫液，1ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每1ml收集一管，直至游離ADM全部流出，測(cè)洗脫過(guò)程收集的每管中的藥物濃度，以每管藥物濃度對(duì)管數(shù)作圖，繪制流出曲線，如產(chǎn)品B的流出曲線見(jiàn)附圖6。從分離曲線上得出，流出物依次為：11ml空白洗脫液→10mlADM復(fù)合磷脂毫微粒溶液→7ml空白洗脫液→32ml游離ADM溶液→空白洗脫液。2．2．4．3包封率測(cè)定 根據(jù)“2．2．4．2項(xiàng)下”的柱分離曲線，直接收集25ml體積以后的流出液35ml，移至50ml容量瓶中，加水至刻度，以空白流出液作空白，在479.0±1nm處測(cè)定A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線一中求出ADM的量即Wf。另精密吸取產(chǎn)品B1ml至100ml容量瓶中，用DMSO溶解并定容，測(cè)A值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線二中，計(jì)算出每ml產(chǎn)品B所含ADM總量W總代入公式：包封率（EN％）＝（1－Wf/W總）×100％。Wf為游離ADM含量；W總為磷脂毫微粒中ADM被包封量＋Wf。結(jié)果，產(chǎn)品B包封率為86.65％±0.97（n=3）。同法測(cè)得產(chǎn)品A包封率為70.09％±1.05（n=3），產(chǎn)品C包封率為56.97%±0.69（n=3）。2．2．5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)采用加速試驗(yàn)法，由于磷脂的相變溫度為40-50℃，在75%恒濕條件下，于20，30，40℃進(jìn)行加速試驗(yàn)，見(jiàn)表5。

表5加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果制劑產(chǎn)品溫度（℃）時(shí)間（d）外觀包封率(%)平均粒徑(nm)A200磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻66.47239.2300磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻65.21242.5400磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻64.97248.3B200磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻84.44265.9300磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻82.69269.2400磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻76.54296.4C200磚紅色均勻56.97285.030磚紅色均勻23.27292.4300磚紅色均勻56.97285.030深磚紅色均勻20.50309.6400磚紅色均勻56.97285.030深磚紅色均勻10.07669.7

可見(jiàn)包封率大小依次為B＞A＞C，且隨著時(shí)間增加產(chǎn)品A、B、C的粒徑都有增大的趨勢(shì)，包封率都有減小的趨勢(shì)。B的穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于C。3討論均勻設(shè)計(jì)是我國(guó)學(xué)者方開(kāi)泰教授提出的多因素試驗(yàn)法，以均勻性為出發(fā)點(diǎn)，其試驗(yàn)點(diǎn)散布均勻，可以通過(guò)少量實(shí)驗(yàn)次數(shù)獲得可靠結(jié)果。本研究以提高包封率，制得粒徑小而均勻的產(chǎn)品為目的，采用均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合微機(jī)處理數(shù)據(jù)，優(yōu)化制備條件，科學(xué)性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，為了保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，必須使藥物能從載體中釋放出來(lái)，而且載體材料對(duì)吸收無(wú)干擾。故我們選用兼能溶解藥物及所有基質(zhì)的有機(jī)溶劑，并要求該溶劑在被測(cè)波長(zhǎng)處無(wú)吸收，在試用過(guò)乙酸乙酯、丙酮－甲醇（3：1）、氯仿、四氫呋喃、DMSO等多種有機(jī)溶劑后，最終選定DMSO。因?yàn)镈MSO比其它幾種溶劑溶解性更好，可使混懸液由混濁變透明，且不干擾測(cè)定。參考文獻(xiàn)[6]測(cè)定包封率時(shí)，發(fā)現(xiàn)將產(chǎn)品上柱分離時(shí)如直接以水（PH=7）為洗脫液，毫微粒（或脂質(zhì)體或復(fù)合磷脂毫微粒）能較快流出，而未包入的游離ADM卻難以洗脫下來(lái)，可能是鹽酸阿霉素在PH＝7的水中，以阿霉素形式存在，被葡聚糖吸附的較牢。后改換用PH=5.0的PBS緩沖液則既保證了游離ADM的分離，又使ADM也較快流出。本實(shí)驗(yàn)中制得的復(fù)合磷脂毫微粒乳狀液中可能有未被磷脂包封的毫微粒存在，但兩者的粒徑范圍有大部分為交叉重疊，只通過(guò)S