植物的快速繁殖和脫病毒技術(shù)

第5章植物的快速生殖和脫病毒技術(shù)利用離體培育技術(shù)，將植物外植體在人工培育基和適宜的條件下進(jìn)展培育，以在短期內(nèi)獲得大量遺傳性全都的個(gè)體的方法稱為離體快速無性生殖，簡(jiǎn)稱為離體生殖〔invitropropagation〕、微生殖〔micropropagation〕或快速〔養(yǎng)分〕生殖〔rapidpropagation〕。由離體無性生殖獲得的植株稱為試管苗。無性系(無性生殖系，克隆〕：由同一外植體或細(xì)胞增殖的培育物。一般適用范圍：加速難生殖或生殖緩慢植物的生殖.易染病毒植物的脫毒生殖.不能用種子生殖的雜合體園藝作物.產(chǎn)生的品種.第1離體快繁的一般技術(shù)途徑和方法:快速生殖過程一般分成以下幾個(gè)階段:預(yù)備階段〔0階段〕增殖階段：芽的增殖,促長(zhǎng)；生根階段：誘導(dǎo)芽生根；無菌培育物的建立(初代培育;primaryculture)一般過程包括:外植體的選擇和消毒培育基和植物生長(zhǎng)物質(zhì)的選擇環(huán)境條件的選擇和培育初代培育留意事項(xiàng)保證無菌條件適宜技術(shù)過關(guān)防止褐變褐變緣由：外植體中的酚類化合物在多酚氧化酶的作用下氧化。影響褐變的因素植物種類和基因型外植體的取材部位和生理狀態(tài)培育基成分防止褐變的常用方法〔目前尚無通用的防止褐變的有效方法.〕選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w選擇適宜的培育基和培育條件使用抗氧化劑準(zhǔn)時(shí)轉(zhuǎn)接等增殖階段(芽的增殖;shootmultiplication)使外植體在數(shù)量上快速增加。羅士韋〔1978〕:植物離體分化過程的類型分5種：:節(jié)培法;微型扦插法叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖型李文安〔1998〕:分10類器官型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖型球莖芽型塊莖型鱗莖型孢子型根莖型微枝扦插型促進(jìn)側(cè)芽的形成和生長(zhǎng)〔叢生芽增殖型；促進(jìn)腋生分枝〕根本過程：初代培育的芽在適宜的培育基上培育，使側(cè)芽不斷分化和生長(zhǎng)，漸漸形外植體：頂芽或側(cè)芽。植物生長(zhǎng)物質(zhì)：細(xì)胞分裂素:常用6-BA、KT、2ip和Zt等;一般加0.1~10mg/L，常用0.5~2mg/L；生長(zhǎng)素常用NAA、IBA和IAA，濃度為0.1~1.0mg/L。;1000~2000lx照明，每日16h或24h〔或全黑暗〕。特點(diǎn)：能較好保持遺傳穩(wěn)定性；但過程較簡(jiǎn)單。誘導(dǎo)不定芽形成不定芽：.在很多器官和愈傷組織上都能誘導(dǎo)出不定芽。但可使嵌合性狀遭到破壞〔圖5-1〕。和Zt,濃度0.1~10mg/L;常用生長(zhǎng)素：NAA，IAA和IBA。二者比例:一般細(xì)胞分裂素高于生長(zhǎng)素，但也有承受接近1的配比。圖5-1雜色天竺葵的莖尖〔上〕和葉柄〔下〕培育誘導(dǎo)胚狀體的形成(體細(xì)胞胚胎發(fā)生Somaticembryogenesis〕外植體選擇： 使用合子胚、分生組織或子房、花藥等生殖器官.植物其它局部也有直接或間接產(chǎn)生胚狀體的力量.培育條件：豐富銨態(tài)氮的培育基上,加2,4-D誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生,然后轉(zhuǎn)移到降低2,4-D濃度或沒有生長(zhǎng)素的培育基上使胚狀體成熟和萌發(fā).優(yōu)點(diǎn)：增殖率高,且具雙極性. 應(yīng)用：人工種子等缺點(diǎn)：很多主要的作物還不能形成胚狀體,或產(chǎn)生的胚狀體難以形成植株,或成苗率太低,以及遺傳性不夠穩(wěn)定。生根〔根的誘導(dǎo);根的再生;Rooting〕方法：將增殖的芽剝離下來，分別種植到的培育基上，誘導(dǎo)生根。,其它的需要在培育基中參加適量的生長(zhǎng)素,一般濃度為1~10.0mg/L,常用NAA、IBA和IAA。根本培育基：一般用鹽濃度較低的培育基。蔗糖濃度可降低到1.0~1.5%左右。試管苗的移栽〔Transplantation〕煉苗〔馴化〕：試管苗逐步熬煉和適應(yīng)外界環(huán)境條件的過程.,表皮毛無或極少而薄,氣孔不能關(guān)閉等.過程：漸漸降低濕度,漸漸增加光照；加生長(zhǎng)延緩劑等?？焖偕成a(chǎn)中應(yīng)留意的問題遺傳穩(wěn)定性影響遺傳穩(wěn)定性的因素主要有：外植體來源繼代培育再生植株發(fā)生方式D植物生長(zhǎng)物質(zhì)提高遺傳穩(wěn)定性,削減變異發(fā)生的措施主要有:a選擇適宜外植體b削減繼代次數(shù),縮短繼代時(shí)間;c使用生長(zhǎng)點(diǎn)或側(cè)生分枝方式擴(kuò)繁;d選用適當(dāng)?shù)闹参锷L(zhǎng)物質(zhì)種類和較低濃度等e定期檢查,剔除形態(tài)和生理特別苗;f盡量促進(jìn)再生植株開花結(jié)實(shí),以檢查其生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀是否穩(wěn)定.玻璃化組培中特有的一種生理病變。影響玻璃苗發(fā)生的因素：培育材料環(huán)境因素培育基成分可能的預(yù)防性措施：降低容器內(nèi)的空氣相對(duì)濕度。留意通氣，改善容器內(nèi)的氧氣供給。避開培育溫度過高，一般晝夜變溫交替效果較好。酌情調(diào)整光照時(shí)間和強(qiáng)度等。NH4+濃度，依據(jù)具體狀況調(diào)整其他元素的含量。適當(dāng)降低培育基中細(xì)胞分裂素的濃度。留意碳源種類和濃度的選擇。PP或 等。PP333快繁實(shí)例唐菖蒲(Gladiolusgandavensis)月季7~10d消毒莖尖→→MS0① ② ↓↓③MS+6-芐基嘌呤(BA)1.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.01mg/L或MS+6-BA1.0mg/L+感動(dòng)素1.0mg/L+NAA0.5mg/L的固體培育基25d形成芽叢(每個(gè)莖尖可產(chǎn)生10~40個(gè)芽)⑤↓芽叢切割,重復(fù)③~⑤月季快繁

⑥↓延長(zhǎng)培育,苗的基部漸漸膨大，芽梢伸長(zhǎng)轉(zhuǎn)綠2.0cm時(shí)MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L固體培育基上誘導(dǎo)生根7~8天見到根的突起,20多天可產(chǎn)生大量的根⑨↓進(jìn)展移栽.強(qiáng)健優(yōu)良母株的嫩莖去葉↓消毒(70%酒精0.5~2sec,0.1%HgCl2

5~8min),↓嫩莖切段(0.5~1.0cm)固體培育基〔MS+6-BA0.5~3.0mg/L+NAA0.01~0.2mg/L〕↓日溫20~250C,夜溫15~200C,每日光照10h,光照強(qiáng)度1000lx.↓20d左右 ↑形成叢生芽→芽叢切割→→↑↓壯苗培育〔MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L固體培育基〕↓枝條長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，切下枝條誘導(dǎo)生根〔MS+1mg/LIBA或0.5~1.0mg/LNAA〕↓7~10d基部愈合并形成根原基↓將苗取出，直接插入稻殼灰與土(1:1)的養(yǎng)分缽中,用塑料薄膜掩蓋↓5~6天小苗生根,梢生長(zhǎng) 1Mon. 定植或上盆.第2節(jié)無病毒植物的培育附表：危害局部園藝植物的病毒數(shù)目防治植物病毒病的方法物理方法1〕熱處理脫病毒〔又稱溫?zé)岑煼?，thermotherapy〕：溫湯浸漬處理(溫水浸泡)：適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料；熱風(fēng)處理〔干熱處理〕：休眠組織和正在生長(zhǎng)的組織都適用，特別是莖尖培育結(jié)合熱處理可獲得較抱負(fù)的脫病毒效果。熱處理的時(shí)間和溫度因植物種類及器官生理?xiàng)l件不同而異.原則：既能使體內(nèi)病毒鈍化,又能保證肯定程度的寄主存活率.2) 低溫處理脫病毒〔冷凍法：cryotherapy〕化學(xué)方法利用能鈍化、抑制和消退植物病毒的一些化合物化合物植物病毒*寄主三氮唑核苷CMV,PVY,TMV煙草(ribavirin)ACLSV蘋果LSV,TBV百合ORSV大花惠蘭PVY,PVX,PVS,PVM馬鈴薯EMCV茄子阿糖腺苷(vidarabine)OMV虎眼萬年青堿性孔雀綠(malachitegreen)PVX馬鈴薯2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)PVY煙草放線菌素-D(actinomycin-D)TMV大白菜*：CMV：黃瓜花葉病毒；PVY：馬鈴薯病毒Y；TMV：煙草花葉病毒；ACLSV：蘋果褪綠葉斑病毒；LSV：毒S；PVM：馬鈴薯病毒M；EMCV：茄子雜色皺病毒；OMV：虎眼萬年青花葉病毒。生物方法種子生殖 適用于不侵染種子的病毒.但無性生殖作物不適宜.莖尖培育(shoot-tipculture)莖尖培育脫毒的原理越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，病毒濃度越低?？赡芫売桑簜鲗?dǎo)抑制；酶缺乏；能量競(jìng)爭(zhēng)；抑制因子莖尖培育脫毒一般過程.剝離和接種培育條件影響莖尖培育脫毒成功的因素脫毒培育是否成功取決于兩點(diǎn):離體莖尖能否成活;成活的莖尖還有沒有病毒.莖尖大小,越易成活,但病毒越難去除.一般帶一兩個(gè)葉原基的莖尖比較適宜.培育基植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類和濃度莖尖培育的根本過程選擇母株──可能時(shí)預(yù)先進(jìn)展病毒測(cè)定──必要時(shí)進(jìn)展預(yù)先熱處理(30~36oC,6~12周)剝離適宜大小的莖尖↓培育─必要時(shí)可熱處理(30~40oC)↓─必要時(shí)在培育基中參加抗病毒化合物再生植株↓切段或其它生殖形成的無性系↙ ↓ ↘局部保存 局部移入室內(nèi)備病毒鑒定用 局部試管苗直接用于病毒鑒定↓ ↓↓ (1)指示植物(2)免疫學(xué)(3)電鏡(4)分子生物學(xué)方法保存→移栽→無性系選擇(有無生理或遺傳上的變異)↓ ↘品種比照試驗(yàn)(產(chǎn)量,對(duì)環(huán)境適應(yīng)性及抗病性等)選擇適宜的無性系進(jìn)展大量生殖↓無病毒原原種↓擴(kuò)大繁育生產(chǎn)體系↓〔microgrfting，離體微型嫁接〕是將莖尖培育與嫁接方法相結(jié)合，用以獲得無病毒苗木的技術(shù)。培育，愈合后成為完整植株。因接穗易成活，可培育很小的莖尖〔<0.2mm〕目前主要應(yīng)用在果樹脫毒方面。珠心組織培育柑橘類多胚品種有多個(gè)珠心胚。問題：變異率較高〔約20%~30%〕，幼年期較長(zhǎng)等。愈傷組織培育脫毒法可能得到無病毒苗?？赡艿臋C(jī)理：①病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組織中分布不均勻。的復(fù)制力量衰退或喪失。問題：易產(chǎn)生變異。莖圓盤半球培育法〔stem-discdomeculture,簡(jiǎn)稱SD-Domeculture〕植株感病的大蒜蒜瓣↓外表消毒切成薄片↓接種在含激素的培育基上↓5d圓盤外表長(zhǎng)出半球體↓在培育的5~7d后從外植體剝離半球體,轉(zhuǎn)移到無激素的LS培育基上↓2周高約1cm的苗↓8周帶根的高8cm的試管苗↓移栽(不呈現(xiàn)病毒病癥)↓進(jìn)展RT-PCR分析(,結(jié)果說明這些植株均不含供體植株攜帶的大蒜病毒)再生植株病毒鑒定病癥直接檢測(cè): 植株莖葉中是否有該病毒所特有的可見病癥.指示植物測(cè)定:指示植物：對(duì)某種或某些特定病毒格外敏感的植物.將受檢植物的液汁輕輕涂于指示植物葉片上,加細(xì)石英砂適當(dāng)用力磨擦,使指示植物葉外表受到侵染,但又不要損傷葉片…….:先給動(dòng)物注射病毒獲得抗血清,再將分別的待測(cè)植株液汁參加,觀看有無沉淀消滅?！睧LISA〕：用酶標(biāo)記抗原或抗體的微量測(cè)定法。電鏡法:直接觀看有無病毒微粒的存在，以及微粒的大小、形態(tài)和構(gòu)造，借以鑒定病毒的種類。分子生物學(xué)方法：核酸雜交；PCR；dsRNA等。操作實(shí)例：葡萄脫毒及無毒苗試管生殖技術(shù)〔曹孜義等，1991〕將盆栽葡萄在38oC熱處理箱中處理2~3個(gè)月，然后把長(zhǎng)出的枝蔓消毒，再取下頂尖和側(cè)芽，剝?nèi)?~3mm長(zhǎng)的莖尖，接種到莖尖培育基上〔1/2MS根本培育基，每升