異氟醚、安氟醚誘導(dǎo)麻醉對(duì)大鼠邊緣系統(tǒng)nos陽性神經(jīng)元的影響

異氟醚、安氟醚誘導(dǎo)麻醉對(duì)大鼠邊緣系統(tǒng)nos陽性神經(jīng)元的影響

氟醚異氟醚和氟醚是目前常用的麻醉劑，但其誘導(dǎo)機(jī)制尚不完全清楚。一氧化氮(NO)由L-精氨酸通過一氧化氮合酶(NOS)生成。邊緣系統(tǒng)的下丘腦、隔區(qū)、杏仁簇核神經(jīng)元均含有NOS,已有研究證明NO在外周及中樞的不同水平的痛覺調(diào)控中起一定作用,并與麻醉作用密切相關(guān)。但NO是否參與異氟醚、安氟醚在邊緣系統(tǒng)的作用尚無明確的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究擬應(yīng)用NADPH-d組化法來觀察異氟醚、安氟醚麻醉誘導(dǎo)期大鼠邊緣系統(tǒng)NOS陽性神經(jīng)元的改變,探討大鼠邊緣系統(tǒng)部分NOS陽性核團(tuán)是否參與異氟醚、安氟醚的麻醉誘導(dǎo)作用,并為吸入麻醉藥在邊緣系統(tǒng)作用機(jī)制的研究提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。小鼠腦電nadph-d試劑與儀器異氟醚、安氟醚系雅培公司產(chǎn)品(英國),β-NADPH為Sigma公司產(chǎn)品(美國),氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)為Flulca公司產(chǎn)品(美國),LeicaCM1100冰凍切片機(jī)、LeicaQwin圖像分析處理系統(tǒng)由Leica公司(德國)提供。動(dòng)物模型及分組SD大鼠18只,全部雄性,年齡34月,體重200250g,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、異氟醚組、安氟醚組,每組6只。對(duì)照組動(dòng)物除不吸入麻醉氣體外,其他條件均與異氟醚組、安氟組相同。兩組大鼠分別吸入2%安氟醚或2%異氟醚至步態(tài)不穩(wěn)、一側(cè)肢體著地,即翻正反射即將消失時(shí),移出麻醉箱,立即取標(biāo)本。組織切片各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移出麻醉箱后,立即用烏拉坦麻醉,開胸,經(jīng)升主動(dòng)脈灌流固定,斷頭取腦置于30%蔗糖液中至組織塊沉底,持續(xù)冠狀冰凍切片,片厚40μm,連續(xù)取片,隔三取一。安氟醚和異氟醚組分3套切片,第一套用NADPH-d組織化學(xué)染色;第二套用中性紅普通細(xì)胞染色,確定陽性核團(tuán)的位置;第三套用于陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。NADPH-d組化法將切片放入含0.5mg/mlNADPH-d,0.6mg/mlNBT,溫育(37℃)1h。將切片移入0.01mol/1PBS液中終止顯色反應(yīng)。常規(guī)脫水、透明、封片、光鏡觀察記數(shù),圖象分析并照相。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較用t檢驗(yàn),采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,P<0.05為差異有顯著性。安氟醚對(duì)大鼠腦邊緣中nos陽性神經(jīng)元的影響各組大鼠邊緣系統(tǒng)切片NOS陽性神經(jīng)元的胞體和突起呈藍(lán)色,顯色清楚集中,而胞核不著色,各陽性神經(jīng)核團(tuán)在邊緣系統(tǒng)為雙側(cè)對(duì)稱分布,無側(cè)偏現(xiàn)象,見圖1。NOS陽性神經(jīng)元以每個(gè)核團(tuán)內(nèi)的個(gè)數(shù)表示數(shù)量,無論染色深淺,只要顯示NOS陽性神經(jīng)元特征,在低倍和高倍鏡下背景區(qū)分明確,即予以計(jì)數(shù)。染色深淺用LeicaQwin圖像分析與處理系統(tǒng)進(jìn)行染色深度分析,用平均灰度水平表示。結(jié)果見表1,表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠吸入2%安氟醚或安氟醚后,翻正反射消失的潛伏期分別為(2.6±0.5)min、(2.1±0.4)min。安氟醚組鼠腦邊緣系統(tǒng)中隔外側(cè)核、杏仁外側(cè)核、下丘腦室周核、下丘腦室旁核、視上核和伏隔核等6個(gè)核團(tuán)NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。異氟醚組在上述6個(gè)核團(tuán)中NOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量和平均灰度水平也低于對(duì)照組,唯下丘腦室周核和視上核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目有減少趨勢,但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余核團(tuán)與對(duì)照組比較差別均有顯著性(P<0.01)。杏仁核與異氟醚、安氟醚的相互作用翻正反射消失是常用的動(dòng)物麻醉的指標(biāo)。大鼠吸入麻醉藥后步態(tài)不穩(wěn)、翻正反射即將消失時(shí)相當(dāng)于麻醉誘導(dǎo)期。NO作為一種細(xì)胞間信使分子,在神經(jīng)系統(tǒng)作為一種空間信號(hào)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),參與機(jī)體傷害感受性傳遞和維持清醒狀態(tài)。有研究表明NO-cGMP信息途徑可能與全麻藥作用機(jī)制有關(guān)。神經(jīng)NOS(nNOS)特異性抑制劑7-nitroindazole(7-NI)能使大鼠異氟醚的最低肺泡有效濃度(MAC)呈劑量依賴性降低。馮征等報(bào)道異氟醚劑量依賴性抑制大鼠皮層、腦干、海馬及小腦突觸體NOS活性和NO含量。李元濤報(bào)道,安氟醚誘導(dǎo)期能抑制大鼠腦皮質(zhì)、腦干、海馬的NOS活性和NO產(chǎn)量,并與行為變化相一致。但他們使用的是神經(jīng)生化方法,未能闡明二藥的具體作用部位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持異氟醚、安氟醚麻醉抑制中樞NO-cGMP信息途徑的觀點(diǎn)。有研究證實(shí)腦內(nèi)NOS主要位于腦皮質(zhì)、腦干、小腦及邊緣系統(tǒng)的上丘腦、下丘腦、海馬、隔區(qū)和杏仁簇核。邊緣系統(tǒng)在種系發(fā)生上是比較古老的,是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌、學(xué)習(xí)記憶和睡眠的中樞系統(tǒng)。邊緣葉、與邊緣葉皮質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域,以及在功能和聯(lián)系上較密切的一些皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)包括在一起,稱為邊緣系統(tǒng)。視上核(Supraopticnucleus,SO)是丘腦下部最重要的核團(tuán)之一,內(nèi)有內(nèi)分泌性神經(jīng)元,除分泌加壓素和催產(chǎn)素外,還分泌亮氨酸腦啡肽、強(qiáng)啡肽和β-內(nèi)啡肽。有研究表明刺激視上核能明顯提高疼痛閾值,使β-內(nèi)啡肽和亮氨酸腦啡肽釋放增加,因此認(rèn)為視上核可能參與痛覺的調(diào)控。有報(bào)告通過腦薄片全細(xì)胞技術(shù)觀察到安氟醚和異氟醚使視上核神經(jīng)元放電頻率明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:安氟醚組視上核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。異氟醚組視上核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量有減少趨勢,與對(duì)照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但其平均灰度水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01),因此認(rèn)為視上核NOS陽性神經(jīng)元改變均參與了異氟醚、安氟醚誘導(dǎo)過程。結(jié)合以上結(jié)果認(rèn)為,安氟醚和異氟醚興奮視上核使內(nèi)啡肽分泌增加,影響NOS陽性神經(jīng)元,可能是安氟醚、異氟醚麻醉鎮(zhèn)痛作用的重要機(jī)制。同時(shí)二藥影響加壓素和催產(chǎn)素的分泌,表現(xiàn)為臨床麻醉誘導(dǎo)中的心血管系統(tǒng)的改變。下丘腦室旁核(Pa)是重要的調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的較高級(jí)中樞。下丘腦室旁核存在NOS/NO系統(tǒng),它通過非膽堿能非腎上腺能纖維下行投射影響各級(jí)交感神經(jīng)中樞,還通過影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和肽類的合成及釋放,對(duì)心血管系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,異氟醚或安氟醚通過下丘腦室旁核中NOS陽性神經(jīng)元改變而影響NOS/NO系統(tǒng),調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng),這與吸入麻醉誘導(dǎo)期的心血管反應(yīng)有關(guān)。杏仁核也是邊緣系統(tǒng)的一個(gè)重要核團(tuán),刺激該核團(tuán)可表現(xiàn)為情緒、呼吸、血壓、心率和內(nèi)分泌的改變和鎮(zhèn)痛作用,這與麻醉誘導(dǎo)過程極為相似。徐禮鮮等研究報(bào)道,安氟醚、異氟醚吸入1h能誘導(dǎo)杏仁基外側(cè)核、杏仁基內(nèi)側(cè)核的Fos陽性神經(jīng)元明顯增加,抑制中央杏仁核的自發(fā)放電活動(dòng)。從本實(shí)驗(yàn)中觀察到,杏仁基外側(cè)核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度水平降低。推測杏仁核參與了異氟醚、安氟醚麻醉過程,其作用機(jī)理部分與NOS陽性神經(jīng)元的改變有關(guān)。隔核是許多纖維系統(tǒng)來往貫穿的區(qū)域,外側(cè)隔核是主要接受傳入纖維,內(nèi)側(cè)隔核發(fā)出傳出纖維。隔核還參與視聽覺傳遞過程,并由此起引情緒變化。伏隔核(Ab)是基底前腦的一個(gè)較大核