PCR技術(shù)在食品微生物中的檢測

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應用報告人：馮姣PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應用PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的存在問題目錄PCR技術(shù)簡介Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis創(chuàng)造了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶〔Taq〕引入了PCR技術(shù)。1989年美國?Science?雜志列PCR為十余項重大科學創(chuàng)造之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。PCR技術(shù)的創(chuàng)立史PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)的原理無細胞分子克隆法：在微量離心管中,參加適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)分類熒光定量PCR常規(guī)PCR檢測多重PCR檢測熒光定量PCR檢測IMS-PCR檢測PCR-DGGE在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，常規(guī)PCR檢測原理是在存在DNA模板、dNTP、引物、適當緩沖液與MgCl溶溶液的反響混合物中，對一對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進行擴增。多重PCR(multiplexPCR)的檢測原理與傳統(tǒng)PCR相同，如果存在與各引物對特異性互補的模板，只不過是在同一反響體系中參加1對以上的特異性引物，那么就可以同時在同一個反響管中擴增出1條以上的目的DNA片段。使用這一方法可以同時檢測1個以上目的基因或者借助其交叉限制進行確認。與常規(guī)的PCR相比，還具有擴增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟簡便等特點，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測.實時熒光定量是將熒光能量傳遞技術(shù)應用于傳統(tǒng)多聚酶鏈式反響儀中，通過受體發(fā)色團之間偶極–偶極相互作用。檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度，能量從供體發(fā)色團轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與DNA產(chǎn)量成正比，從而到達定量目的。該技術(shù)實現(xiàn)了ＰＣＲ從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)ＰＣＲ的快速、靈敏、操作方便等特點外，還具有以下優(yōu)點：全封閉反響，無需凝膠電泳等ＰＣＲ后處理，減小對環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作平安；定量準確；儀器在線實時監(jiān)測，結(jié)果直觀免疫磁珠技術(shù)〔ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ〕其原理是磁珠經(jīng)過一定的處理后，可結(jié)合某種微生物特異性抗體，形成免疫磁珠。將這種帶有特異性抗體的免疫磁珠加到待測樣品中，相應的抗原物質(zhì)就會和免疫磁珠上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠免疫復合物，此復合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，使復合物與其他物質(zhì)別離，從而到達快速別離抗原物質(zhì)的目的。該技術(shù)不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)點以及免疫學反響的高度特異性，還具有高效、快速、可重復性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點。PCR-DGGE的技術(shù)是將PCR和變性梯度凝膠電泳的(DGGE)分析技術(shù)結(jié)合起來是一種可將長度相同而序列不同的DNA片段混合物別離開的一項技術(shù)。DGGE的根本原理是：由于DNA分子中4種堿基的組成和排列存在差異，造成不同序列的DNA分子的解鏈溫度不同，解鏈時所需的變性劑的濃度也不同。當雙鏈DNA分子在含梯度變性劑〔尿素、甲酰胺〕的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，會致使序列不同的DNA片段會在各自相應的變性劑濃度下變性，從而使DNA分子的遷移速度不斷下降，當產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相對平衡時，不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細，有一個堿基差異的DNA長段都可以被分開。PCR-DGGE技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復性好等優(yōu)點。①檢測樣品經(jīng)預處理后獲得DNA模板；②DNA模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為其后階段反響做準備；③模板DNA與引物的退火〔復性〕：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，這時人工合成的引物與模板DNA單鏈經(jīng)互補序列配對結(jié)合；④引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下，以4種三磷酸脫氧核苷酸為反響原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保存復制原那么，合成一條新的與模板DNA結(jié)構(gòu)組成相同的新鏈。重復循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的新鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次DNA便可擴增l00萬~200萬倍。PCR反響產(chǎn)物再通過凝膠電脈和基因測序等DNA分析技術(shù)確定擴增DNA序列的具體信息。PCR技術(shù)簡介PCR操作過程準確性用傳統(tǒng)的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難，那是因為，食品中污染微生物種類相當多，即使是同一種食品中微生物種類也相當多?？旖菪砸话愕母瘮【鷻z測至少需要2～5d，甚至7d以上，由此可見，傳統(tǒng)的檢測方法最大的缺點就是檢測需要時間太長了。檢驗結(jié)果出來時通常產(chǎn)品已經(jīng)流向市場，對實際生產(chǎn)具有嚴重的滯后性。而PCR技術(shù)檢測食品微生物可以在1d之內(nèi)檢測出結(jié)果，甚至在幾個小時就可以得出檢測結(jié)果，對食品工業(yè)生產(chǎn)具有相當好的指導作用。PCR技術(shù)檢測食品微生物的優(yōu)勢1.食