PCR技術(shù)簡介課件

PCR技術(shù)簡介主要內(nèi)容PCRRT-PCR〔reversetranscriptional-PCR〕瓊脂糖凝膠電泳PCR的概念PCR〔polymerasechainreaction〕即聚合酶鏈反響技術(shù)，它是以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，利用耐熱DNA聚合酶的酶促作用，通過變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，快速特異地擴(kuò)增出特定的DNA片斷。DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年Mullis等人創(chuàng)造了聚合酶鏈反響〔PCR〕耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后誕生了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1989年美國?Science?雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)創(chuàng)造之首,比喻1989年為PCR爆炸年1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎PCR技術(shù)簡史PCR的原理PCR反響時，一般采用變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)。1．變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。

2．復(fù)性〔退火〕：通過降低反響溫度至45-700C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的3`端粘合。PCR的原理PCR的主要用途目的基因的克隆基因的體外突變生成大量DNA以進(jìn)行序列測定特異基因表達(dá)量分析PCR反響體系20ul；25ul；50ul

濃度50ul體系(ul）10×PCRBuffer5Mg2+1.5mmol/L4dNTPs200umol/L4引物110pmol2引物210pmol2模板0.1～2ug1Taq酶2.5u0.5ddH2O31.5PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑Taq酶0.5-2.5U/50l〔通常2.5U/50l〕酶量增加使反響特異性下降;酶量過少影響反響產(chǎn)量從生物公司購置：生工；華美；Takara;Promega;與buffer,mg2+成套出售

Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑1.5mmol/L-2.5mmol/L反響體系〔通常4l/50l〕Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反響特異性PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑Buffer提供適宜的PH值有10×buffer和2×buffer有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2+PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑dNTPdATP，dTTP，dGTP，dCTP可以購置dNTP混合液，也可以購置dATP，dTTP，dGTP，dCTP等體積混合四種dNTP濃度應(yīng)相等每種200umol/L〔通常4l/50l〕濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低那么降低反響產(chǎn)量PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑模板〔DNA或cDNA〕單、雙鏈DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類一般50ngDNA模板/50L模板濃度過高會導(dǎo)致反響的非特異性增加提取細(xì)胞或組織中的基因組DNAPCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑ddH2O滅菌的去離子水或雙蒸水PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備—試劑引物0.1-0.5mol/L〔通常10pmol的引物2ul/50ul〕濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配，反響特異性下降利用軟件〔Omiga、Primerprimier〕設(shè)計引物后，由生物公司〔生工、賽百盛〕合成，收到合成完畢的引物后根據(jù)說明對引物進(jìn)行稀釋，一般稀釋成10pmol使用引物設(shè)計中需關(guān)注的有上下游引物之間的長度，即將來PCR產(chǎn)物的大??；以及上下游引物的Tm值，即將來PCR中的退火溫度PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備--試劑引物設(shè)計原那么：1.長度以15－30個堿基為宜2.正向反向兩條引物鏈之間的距離適中，一般使擴(kuò)增出的片斷在300-1100bp之間。如果使用RT-PCR檢測RNA病毒，引物間距離以500bp最正確。片斷過短影響結(jié)果判定，過長那么不易擴(kuò)增3.引物堿基組成應(yīng)隨機(jī)分布，G+C含量在45-55％為宜。過高或過低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大4.引物自身不形成二級結(jié)構(gòu)，引物間沒有互補(bǔ)序列〔4個堿基以上〕，引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反響失敗5.引物序列具有特異性6.引物3`端堿基與模板DNA一定要配對，并且3`末端堿基最好選T、C或者G，不選A。因?yàn)锳在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相比照較高PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備--儀器、耗材PCR儀移液器吸頭200ulPCR管EP管架槍頭盒PCR板冰盒1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR反響程序PCR反響程序預(yù)變性(94C,3m)變性(94C,30s)復(fù)性(50-70C,30s)延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72C,10m)(25-35)變性溫度:94?Cor95?C,不變；延伸溫度：72?C，不變；退火溫度：50?C左右，可變，Tm值-5延伸時間：30-60s，與PCR產(chǎn)物的大小有關(guān)，參考酶的延伸效率〔通常1000bp/min〕PCR反響程序(1)94℃變性3min，(2)94℃變性30sec，(3)52℃退火30sec，(4)72℃延伸1min。(5)goto(2)repeat29,〔6〕72℃延伸10min?！?〕holdat4℃。PCR操作過程

加樣順序50ul體系(ul）10×PCRBuffer5Mg2+34dNTPs44引物152引物262模板71Taq酶80.5ddH2O131.52混勻，瞬時離心3-5secPCR操作過程PCR操作過程RT-PCR〔reversetranscriptional-PCR〕RT-PCR原理DNA聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增RT-PCR主要用途檢測特異基因的表達(dá)量特異基因的組織定位構(gòu)建cDNA文庫鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變RT-PCR反響體系10×buffer2ulMg2+4uldNTP2ulRnaseInhibitor0.4ulAMVRnaseXL0.4ulAMV-Taq0.4ulH2O3.8ul引物Ⅰ1ul引物Ⅱ1ulRNA(≤1ug)5ul一步法RT-PCRRT-PCR反響體系ComponentsVolume(μl)RNA8(1μg)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/μl)0.4AMV-RT((10U/μl)1.0DEPC-H2O3.6Total20兩步法RT-PCRComponentsVolume(μlR.T.Product5.010xPCRbuffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21TaqDNApolymerase1ddH2O12Total25cDNAPCR擴(kuò)增cDNA第一鏈合成反響RT-PCR的準(zhǔn)備--試劑提取細(xì)胞或組織中RNA購置RT-PCR試劑盒〔一步法或兩步法〕RT-PCR的準(zhǔn)備--耗材、儀器超凈臺PCR儀移液器吸頭200ulPCR管EP管架槍頭盒PCR板冰盒RT-PCR過程中cDNA第一鏈合成反響所用的槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小時。加樣過程在超凈臺內(nèi)進(jìn)行，需戴手套與口罩。cDNAPCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反響。RT-PCR反響程序(1)42℃30min，(2)94℃3min，(3)94℃變性3min，(4)94℃變性30sec，(5)52℃退火30sec，(6)72℃延伸1min。(7)goto(4)repeat29,〔8〕72℃延伸10min?！?〕holdat4℃。RT-PCR操作過程cDNA第一鏈合成反響所用槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小時。在超凈臺內(nèi)按試劑盒說明書進(jìn)行加樣，加樣過程需戴手套與口罩。cDNAPCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反響。在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行反響。瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳是別離鑒定核酸片段的有效方法，瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，利用電荷效應(yīng)，在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下，帶負(fù)電的核酸分子向正極遷移。利用分子篩效應(yīng)可以別離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子。瓊脂糖凝膠電泳的主要用途別離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子。鑒定DNA片段，如PCR產(chǎn)物的鑒定。純化DNA分子。瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備--試劑瓊脂糖電泳緩沖液：Tris，冰乙酸，EDTA〔TAE〕6X載樣緩沖液〔Loadbuffer〕：溴酚藍(lán)，蔗糖染色液：goldviewDNA或RNA樣品DNA分子量marker瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備--儀器、耗材電泳儀電泳槽微波爐三角瓶移液器電子天平槍頭凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳的操作過程1g瓊脂糖參加100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解?！怖鋮s到60℃，參加5μl的goldview，并搖勻?！逞b好制膠板，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖〔約50℃〕倒入，室溫冷卻凝固。充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。瓊脂糖凝膠