基于物種多樣性的厭氧反應(yīng)器內(nèi)顆粒污泥微生物種群結(jié)構(gòu)研究

基于物種多樣性的厭氧反應(yīng)器內(nèi)顆粒污泥微生物種群結(jié)構(gòu)研究

產(chǎn)甲烷污泥是高效厭氧反應(yīng)體系穩(wěn)定運(yùn)行的基礎(chǔ)和關(guān)鍵?，F(xiàn)在，許多科學(xué)家已經(jīng)研究了它們的形成機(jī)制、微觀結(jié)構(gòu)和微生物群。然而，在之前的研究中，很難使用電鏡觀察、培養(yǎng)基培養(yǎng)和計(jì)數(shù)等傳統(tǒng)方法。這些方法可以由于自身的固有局限性而難以精確、深入地研究。生物技術(shù)可以克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于微生物群的研究。一些中國科學(xué)家還將這些技術(shù)用于研究好氧和厭氧微生物群的微生物群，并取得了一些成果。產(chǎn)甲烷污泥結(jié)構(gòu)特殊，其中古細(xì)菌與真菌并存。用分子生物技術(shù)全面研究微生物群的報(bào)道相對較少。在本實(shí)驗(yàn)中，以厭氧產(chǎn)甲烷反應(yīng)不同運(yùn)營階段的污泥為研究對象，使用原熒光原雜交技術(shù)（昆蟲）研究樣品中真菌和真菌的相對數(shù)量和空間分布，并比較不同樣品中真菌和假菌的結(jié)構(gòu)差異。通過對舊細(xì)菌dgge譜中條段的膠回收、系統(tǒng)發(fā)育分析，以及根據(jù)器官技術(shù)條件對研究結(jié)果進(jìn)行了討論和分析。1材料和方法1.1產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品的取得試驗(yàn)中產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品取自本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的一個小試厭氧反應(yīng)器,反應(yīng)器為有機(jī)玻璃制成,總體積15L.接種污泥為處理實(shí)際淀粉廢水的EGSB內(nèi)的顆粒污泥.試驗(yàn)進(jìn)水為葡萄糖自配水,按COD∶N∶P約為400∶2.5～5∶1的比例投加尿素和磷酸二氫鉀,反應(yīng)器內(nèi)pH值控制在6.8～7.2之間,溫度在35℃左右.在反應(yīng)器啟動與穩(wěn)定運(yùn)行的過程中,每隔一定時(shí)間從反應(yīng)器底部取出泥樣,共取得4個產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品,其中樣品A:啟動后第1d取得,即接種污泥;樣品B:運(yùn)行25d后取得,反應(yīng)器的COD負(fù)荷約為20kg/(m3·d);樣品C:運(yùn)行75d后取得,反應(yīng)器COD負(fù)荷為35kg/(m3·d);樣品D:反應(yīng)器停止運(yùn)行1個月后,重新啟動運(yùn)行45d后取得,COD負(fù)荷重新恢復(fù)至35kg/(m3·d).1.2細(xì)菌保鮮和成像采集污泥樣品后,立即用4%多聚甲醛溶液固定,待PBS緩沖液洗滌后,于PBS緩沖液和100%乙醇兩者的等體積混合液中在-20℃下保存,再利用石蠟包埋切片技術(shù)進(jìn)行處理.采用CY3(紅色)標(biāo)記的EUB338探針和FITC(綠色)標(biāo)記的ARC915探針,其序列見表1.對上述預(yù)處理后的顆粒污泥樣品進(jìn)行雙重原位雜交,雜交溫度為46℃,雜交甲酰胺濃度分別為25%和35%.同時(shí)利用DAPI(4P,6-diamidin-2-phenylindole)染色作為泥樣中所有微生物的背景,在Olympus激光共聚焦顯微鏡上掃描成像觀察.1.3總dna提取采用滾珠振蕩機(jī)械破碎法提取,將顆粒污泥放入磨砂滾珠離心管中,加CTAB充分振蕩,再用fastprep振蕩破碎儀(Bio-Rad公司)振蕩1min;樣品破碎后,采用溶菌酶蛋白酶K水解,Tris-飽和酚抽提與異丙醇沉淀分離提取DNA;最后采用DNA純化試劑盒A014(鼎國公司)進(jìn)行純化.1.4pcr擴(kuò)增dcke使用PTC-200擴(kuò)增儀(MJ公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增對象為16S-rDNA的V2-V3可變區(qū).對于真細(xì)菌,引物為PRBA8F與PRUN518R;對于古細(xì)菌,引物為PARC109F與PRUN518R;其序列見表2,為提高DGGE分辨效率,在PRUN518R的5′端加GC卡.PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)最終濃度如下:10×PCR緩沖液10%,MgCl2溶液1.5mmol/L,dNTP200μmol/L,引物各0.5μmol/L,模板5ng/μL,TaqDNA聚合酶0.025μ/μL.對于真細(xì)菌,按照94℃變性1min,60℃退火30s,72℃延伸1min循環(huán)25次;對于古細(xì)菌,除退火溫度為55℃外,其它條件均與上述相同.1.5微生物種群相似度在Dcode系統(tǒng)(Bio-Rad公司)上進(jìn)行DGGE分析,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%,真細(xì)菌和古細(xì)菌的變性劑濃度范圍分別是35%～50%和30%～50%,在1×TAE緩沖液中,以120V電壓,60℃恒溫電泳5～6h.電泳后,以1×SYBRGold(Invitrogen公司)染色,用GSD8000成像系統(tǒng)(UVP公司)進(jìn)行結(jié)果觀察和照相.以Phoretix1D軟件(Nonlinar公司)對DGGE圖譜進(jìn)行分析,考察樣品之間的微生物種群的相似性,并繪制相似性分析圖.1.6序和系統(tǒng)發(fā)育分析2結(jié)果與討論2.1產(chǎn)甲烷顆粒污泥的主要細(xì)菌分布對前3個污泥樣品進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖1.在樣品A、B、C中真細(xì)菌含量均明顯高于古細(xì)菌;真細(xì)菌主要分布在顆粒污泥外層,古細(xì)菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長,古細(xì)菌的數(shù)量相應(yīng)略有增加,其分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域.在產(chǎn)甲烷顆粒污泥中,水解菌、發(fā)酵產(chǎn)酸菌以及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌等真細(xì)菌并不是十分嚴(yán)格的厭氧細(xì)菌,且通常這些真細(xì)菌直接吸收和利用原廢水中的有機(jī)基質(zhì),所以這些細(xì)菌通常會生長分布在顆粒污泥的外層;而顆粒污泥中主要的古細(xì)菌是其中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌,它們是嚴(yán)格的厭氧細(xì)菌,且利用真細(xì)菌的代謝產(chǎn)物,因此,在3個樣品中,古細(xì)菌均分布在顆粒污泥的內(nèi)層;同時(shí),厭氧反應(yīng)器的啟動過程實(shí)際上主要就是產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)過程,隨著COD負(fù)荷的逐漸提高以及運(yùn)行時(shí)間的延長,古細(xì)菌的相對數(shù)量逐漸增多.2.2充填泥中真細(xì)菌種群相似性對4個顆粒污泥樣品同時(shí)進(jìn)行總DNA提取、純化,經(jīng)過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行DGGE分析,最終得到其中真細(xì)菌的DGGE圖譜,如圖2所示,利用Phoretix1D軟件對真細(xì)菌的DGGE圖譜進(jìn)行相似性分析,如圖3所示.一般認(rèn)為,在DGGE圖譜上,每一條帶代表某種特定的微生物,且亮度相對大的條帶代表樣品中的優(yōu)勢微生物.因此,圖2表明,與接種污泥A相比,在小試反應(yīng)器中運(yùn)行不同時(shí)間后的樣品B、C和D中真細(xì)菌的種類和優(yōu)勢菌種均發(fā)生了一定的變化;且樣品B與C的真細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)基本相似;而樣品D與B、C相比又有一定的差異.圖3也表明類似的結(jié)果,樣品A與B、C和D的真細(xì)菌種群相似性均較低;樣品B與C的真細(xì)菌種群相似性高達(dá)83%;而樣品D與B、C的真細(xì)菌種群相似性又有所降低.與古細(xì)菌相比,真細(xì)菌生長迅速,易于死亡.接種污泥在接種之前已在常溫、半封閉狀態(tài)下放置了2個月左右,待反應(yīng)器運(yùn)行后,真細(xì)菌的活性逐漸恢復(fù),故接種污泥與小試反應(yīng)器運(yùn)行后的樣品之間,真細(xì)菌種群相似性較低;隨著反應(yīng)器穩(wěn)定的運(yùn)行,顆粒污泥中真細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)沒有因?yàn)镃OD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長發(fā)生顯著的變化;但反應(yīng)器停止運(yùn)行1個月后重新啟動,真細(xì)菌經(jīng)歷了一個死亡后再生長的過程,真細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)再次發(fā)生一定的變化.2.3接種污泥中的古細(xì)菌種對4個顆粒污泥樣品同時(shí)進(jìn)行總DNA提取、純化,經(jīng)過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行DGGE分析,最終得到其中古細(xì)菌的DGGE圖譜,如圖4所示,利用Phoretix1D軟件對古細(xì)菌的DGGE圖譜進(jìn)行相似性分析,如圖5所示.圖4表明,隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長,顆粒污泥中古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較明顯的變化,接種泥樣A中各菌種數(shù)量上相對均勻,而反應(yīng)器運(yùn)行不同時(shí)間后的樣品B、C和D中占優(yōu)勢的古細(xì)菌種類逐漸減少;且古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的變化速率由快到慢,樣品A與其他3個樣品中古細(xì)菌的種類和優(yōu)勢菌種有很大差異,而樣品C與D中古細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)差異較小.圖5也表明類似的結(jié)果,樣品之間的相似性分別為58%、66%和71%,呈逐漸增加趨勢.古細(xì)菌生長易于受到環(huán)境因素的影響,進(jìn)水成分和COD負(fù)荷的差異會導(dǎo)致古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較明顯變化.接種污泥是處理實(shí)際淀粉廢水的厭氧顆粒污泥,進(jìn)水成分復(fù)雜,經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酸過程后,生成的甲烷前體物種類也較復(fù)雜,因此,其古細(xì)菌種類較多.而小試厭氧反應(yīng)器的進(jìn)水為葡萄糖自配水,甲烷前體物種類較單一,使運(yùn)行后期的樣品中優(yōu)勢菌種的種類明顯減少;且接種污泥對應(yīng)的COD負(fù)荷較低,隨著COD負(fù)荷的逐漸增加,古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)不斷地發(fā)生變化,COD負(fù)荷相同的樣品C與D中古細(xì)菌的相似性也較高.即與真細(xì)菌相比,古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)更易受到進(jìn)水成分和COD負(fù)荷改變的影響,這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符.2.4甲烷桿菌屬中的發(fā)育樹將古細(xì)菌DGGE圖譜中有代表性的7個條帶自上至下編號,如圖4所示.對7個條帶切膠回收并測序,其序列輸入Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,并提交序列(AccessionNo.:DQ272259～DQ272265),進(jìn)而繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖6.可知,其中3個序列3、4和6與甲烷桿菌屬中的模式菌種(Methanobacteriumformicicum)相似性達(dá)98%以上;序列5與甲烷微粒菌屬中的模式菌種(Methanocorpusculumparvum)相似性達(dá)99%;序列7與甲烷髦毛菌屬中的菌種(Methanosaetaharundinacea)相似性達(dá)99%;序列1與可培養(yǎng)微生物相似性低,與其他學(xué)者在厭氧反應(yīng)器及自然厭氧環(huán)境中獲得的克隆序列(unculturedarchaeon)相似性達(dá)98%以上;而序列2與Genbank數(shù)據(jù)庫中已有序列相似性均低于95%,很可能是1種未知古細(xì)菌.因此,本研究中的小試厭氧產(chǎn)甲烷反應(yīng)器內(nèi),最適合生長的古細(xì)菌主要包括甲烷微粒菌、甲烷桿菌和甲烷髦毛菌等.3菌株組成中的細(xì)菌(1)顆粒污泥中真細(xì)菌的含量明顯高于古細(xì)菌;真細(xì)菌主要分布在顆粒污泥外層,古細(xì)菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長,古細(xì)菌的數(shù)量相應(yīng)略有增加,其分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域.(2)隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長,真細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定,而