熒光原位雜交技術(shù)原理及應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)原理及應(yīng)用

基于傳統(tǒng)的核電站原始雜交技術(shù)，提出了這種非輻射原位雜交技術(shù)。其基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針,按照堿基互補的原則,與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合,形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列,因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因定位在染色體上。與傳統(tǒng)的放射性標記原位雜交相比,熒光原位雜交具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示間期核。1原聚光燈技術(shù)1.1檢測類型1.1.1基因組的選擇人類和哺乳類基因組內(nèi)都有一些高頻率的重復(fù)序列,在進化上很少具有保守性,如果以基因組為探針,這些存在于靶序列和探針之間的高度重復(fù)序列會首先退火,超過那些單一和保守的序列,因而雜交表現(xiàn)出種的特異性。1.1.2靶位點與雜交信號相結(jié)合類似于a衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針雜交靶位點常常大于1Mb,與靶位點結(jié)合緊密,雜交信號強,易于檢測,常用于檢測間期細胞非整倍和微小標志染色體。1.1.3探針的制備由一條染色體或其上某一區(qū)域極端不同核酸片段組成,可由克隆到噬菌體或粘質(zhì)粒的染色體特征性大片段插入文庫制取,切微切文庫探針片段小,與鄰近區(qū)域發(fā)生重疊或制片中被破壞的可能性小?？捎糜谥衅谌旧w重組和間期核結(jié)構(gòu)分析。1.1.4隆載體與探針的藥物檢測對于存在于基因組內(nèi)的單一序列基因,檢出的最好方法是使用含有插入片段的較大的克隆載體,如Cosmids可載40kb的插入片段,YAC載體能載100~800kb左右的片段。但有研究報道:小到2kb的質(zhì)粒探針仍可用FISH檢測,只是效率很低。主要進行染色體克隆DNA定位和檢測靶細胞序列拷貝數(shù)和結(jié)構(gòu)變化。1.1.5寡聚核苷酸rna探針和探針的制備方法RNA探針包括ssRNA和寡核苷酸RNA探針兩種,其中單鏈反義RNA探針廣泛用于組織切片和整體制備物上。寡聚核苷酸RNA探針與目標形成的雜交體比DNA探針更緊密,同時它可用來鑒別一些特定序列如2個相關(guān)密切的同源性mRNA。而且寡聚核酸RNA探針長度短小,具有超強的穿透性進入細胞核和組織切片。2h再向fibur?在20世紀90年代,FISH在方法上逐步形成了從單色向多色、從中期染色體FISH向粗線期染色體FISH再向fiber!FISH的發(fā)展趨勢,靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多色熒光原位雜交技術(shù)、染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù)、組織微陣排列技術(shù)等。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領(lǐng)域。1.2探針標記標記探針的標記有2種:第1種直接標記法是將熒光分子直接摻入到探針分子中。這種方法快速簡潔,結(jié)果背景干擾少,但雜交信號弱,而且不能進一步放大。第2種間接標記法是將一些類似于半抗原(hapten)的標記分子摻入探針分子中。目前采用的中間分子有:生物素、地高辛配基、2!乙酰氨基芴、汞分子和硫化基團。目前前2者以標記核苷酸類似物的形式被摻入探針的,因此可以采用常規(guī)的缺口平移法、隨機引物法、PCR或RNA體外轉(zhuǎn)錄法進行標記,故最為常用。探針標記通常有2個目的:一方面將標記好的核苷酸加入到探針序列中去,另一方面可以將DNA片段長度縮小到500bp以下。長的探針會導(dǎo)致明顯的背景著色。當用短的探針時可以通過降低甲醛的濃度,增加SSC的濃度,或者降低洗滌溫度來調(diào)整雜交和洗滌條件。探針長度縮短時,相應(yīng)的洗滌時間也要縮短。1.3熒光標記檢測最佳雜交條件取決于探針和目標的性質(zhì)。已標記好的變性的探針(200~500bp)與變性的染色體在37℃、50%的甲酰胺2×ssc條件下進行雜交過夜,接著是柔和的洗滌以去除未雜交或配錯對的探針,然后用熒光標記的檢測試劑檢測常用于標記的熒光分子及其特征如表1。對于單拷貝基因的雜交,特別是較長的來自基因組的序列,一般在雜交以前進行預(yù)復(fù)性過程,標記的探針與過量的基因組DNA或Cot!1重復(fù)序列一起孕育1h,是探針中非特異的重復(fù)序列被封閉,從而抑制該部分探針與染色體間發(fā)生的非特異性雜交。經(jīng)預(yù)復(fù)性之后的探針再與變性的染色體標本雜交過夜。1.4般顯帶的處理先進行染色體顯帶,然后再進行FISH,會明顯降低雜交信號的檢出率,因此,一般顯帶是在雜交以后。常用的方法有Actinomycin/DAPI顯示的G帶,經(jīng)溴尿嘧啶處理后Hoechest染色顯示的R帶等等。采用Alu或ine重復(fù)序列與探針同時進行雜交,亦可得出R帶或G帶的效果。1.5照片記錄的采用熒光鏡檢時顯微鏡的質(zhì)量及濾片的選擇,對滿意結(jié)果的獲得至關(guān)重要。特別是濾片系統(tǒng),應(yīng)嚴格按照表所列的熒光激發(fā)/發(fā)射光波長,選擇最適的激發(fā)/阻擋濾片組和。攝影記錄系統(tǒng)由于固態(tài)電荷耦聯(lián)掃描裝置及圖像分析儀的應(yīng)用,可以很大程度降低背景赭色。應(yīng)用激光共軛聚焦顯微鏡,可以通過對染色體標本的不同平面進行斷層掃描,并將得到的結(jié)果經(jīng)計算機處理,獲得高質(zhì)量的圖像結(jié)果。采用FISH,在中期散色體上直接定位基因,分辨率可達3~20Mb,在間期確定基因之間的距離,分辨率可達50~850kb。2.1實時熒光定量檢測有Multicolor、Multiplex、Multitarget3種類型。最大特點是:可將多次繁瑣的FISH試驗和多種不同基因的定位在一次FISH試驗中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標記探針建立了雙色FISH技術(shù)。1990年Nederlof等提出用3種熒光素探測3種以上的靶位DNA序列,創(chuàng)建了多色FISH方法。在此基礎(chǔ)上又建立了以下5種方法:(1)染色體描繪;(2)反轉(zhuǎn)染色體描繪;(3)多彩色原位啟動標記;(4)比較基因組雜交;(5)光譜染色體自動核型分析;(6)交叉核素色帶分析。2.2織物群落的制備Weigant等和Heng等首先利用化學方法將染色體進行線性化,再以此線性化的染色體DNA作為載體進行FISH,使FISH的分辨率顯著提高,就是最初的纖維-FISH。Parra和Windle(1993),Heiskanen等(1994),Florijn等(1995),進一步改進了伸展DNA纖維的方法,使DNA纖維的伸展程度從最初的80kb/um達到了現(xiàn)在的2.5~3.5kb/um,這一數(shù)值與Watson-Crick建立的DNA雙螺旋模型中B-DNA分子的理論值2.79kb/um十分接近,因此可以說現(xiàn)在得到的DNA纖維基本上是裸露的雙螺旋分子。纖維!FISH的關(guān)鍵就在如何制備高質(zhì)量的線性DNA纖維。纖維!FISH具有高分辨率,能進行定量分析,模板要求不高,只需分析少量的DNA分子(小于10個),靈敏度高等優(yōu)點。2.3tissuemorty和過多回復(fù)突變試驗Microarray可以在1次試驗中檢測出數(shù)百個基因在1個細胞中的表達情況(包括降低和增高)。Tissuearray則在1次試驗中能檢測出1個基因在數(shù)百個細胞中的表達情況。Tissuemicrobary是由Tissuemicrobary區(qū)域中500~1000單個腫瘤組織聯(lián)合筒狀活檢構(gòu)成的,將活檢組織切成200多片用于DNA、RNA探針。單個雜交提供單個載玻片上所有樣本的信號,以后的切片可以用其他探針或抗體分析。同一個組織樣本切片的多重疊區(qū)域可以形成數(shù)千張切片。組織和cDNA微陣排列技術(shù)相結(jié)合提供一種有力的體內(nèi)鑒定基因的方法。2.4改變單次給藥法是一種將免疫核型分析和原位雜交相結(jié)合的方法,這種方法可以同時顯示異種細胞群中單個腫瘤細胞的免疫表現(xiàn)型和一定的基因改變。這種方法和形態(tài)學有關(guān),可以對檔藏材料作回顧性研究。其優(yōu)點是診斷快速,可以再現(xiàn),適合FISH分析前或后沒有所需以前細胞標本的細胞學樣本。2.5其他復(fù)雜的熒光顯微術(shù)它利用多聚核苷酸探針,第一次允許檢測質(zhì)粒上的單個基因或基因片段以及單個細胞中的核酸,這種方法的雜交信號特征包含一個像光暈、圓圈形