熒光原位雜交技術(shù)的研究進(jìn)展

熒光原位雜交技術(shù)的研究進(jìn)展

原子能分子雜交技術(shù)是目前最廣泛應(yīng)用的分子之一。我們可以識別原子間的異質(zhì)性。該技術(shù)是分子克隆技術(shù)的重要組成部分。原位雜交技術(shù)（insituhybridization）是在核酸分子雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門技術(shù),染色體熒光原位雜交技術(shù)的原位雜交不是在溶液中或在濾紙上進(jìn)行，而是在制作的載玻片上進(jìn)行的。染色體熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是利用標(biāo)記好的DNA或RNA與細(xì)胞染色體核苷酸進(jìn)行雜交，檢測后者在細(xì)胞內(nèi)的存在及其數(shù)量和結(jié)構(gòu)改變的方法。單基因特殊染色體區(qū)域，整條染色體或種特異基因組均可特異標(biāo)記而顯示出來。過去探針均采用放射性物質(zhì)——同位素來進(jìn)行標(biāo)記，其靈敏度雖然較高，但有幾個主要缺點(diǎn)：實驗周期長；背影深；分析復(fù)雜；放射性探針不穩(wěn)定；污染環(huán)境，對人體健康不利等。熒光（非放射性）原位雜交正是彌補(bǔ)了以上的缺點(diǎn)。與放射性標(biāo)記相比，非放射性標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)用熒光試劑標(biāo)記探針經(jīng)濟(jì)、安全，同時在特異性、速度、探針穩(wěn)定性方面具有明顯的優(yōu)勢。(2)多色FISH可以在同一核中顯示不同顏色，從而可檢測多種序列。(3)應(yīng)用不同的探針可以顯示某一物種全部基因、某一染色體或染色體片段。(4)能通過幾次免疫化學(xué)反應(yīng)，雜交信號增強(qiáng)顯著，從而提高靈敏度。(5)雜交信號定位更加準(zhǔn)確，分辨率可達(dá)3～20Mb。目前，F(xiàn)ISH經(jīng)過不斷完善，已經(jīng)形成一系列的新技術(shù)，如原位雜交顯帶（insituhybridizationbanding,ISHB）、基因組原位雜交（gnomicinsituhybridization,GISH）、染色體涂色（chromosomepainting）、多元熒光染色體原位雜交等。1雙鏈dna分子從DNA的結(jié)構(gòu)可以得知，DNA為雙鏈雙螺旋分子，其中一條鏈與另一條鏈的核苷酸序列互補(bǔ)。因此，兩條來源不同的具有核苷酸互補(bǔ)關(guān)系的單鏈DNA（或一條DNA和一條RNA）在去掉變性條件后互補(bǔ)的區(qū)段能夠逐步形成雙鏈DNA（或DNA和RNA雜交）分子。一個探針本身是一個具有特定序列的DNA或RNA片段，它能作為DNA分子中某一序列的補(bǔ)充物。靶DNA序列中有其互補(bǔ)序列會在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行結(jié)合（雜交）。熒光原位雜交就是利用這一原理將標(biāo)記探針同組織細(xì)胞或染色體DAN進(jìn)行分子雜交，經(jīng)熒光檢測體系對待測核酸進(jìn)行各種分析。1.1染色體檢測試劑常用的探針是染色體特異性的重復(fù)DNA序列，這些序列定位于染色體的著絲?；蚨肆＃饕糜诳焖贆z測染色體單體和三倍體。還有一種常規(guī)探針是從基因組DNA文庫中分離出來的全長染色體探針，用于染色體的異位或畸變。1.3探針類型的影響雜交前首先雙鏈探針DNA和染色體DNA進(jìn)行變性，變性溫度和時間隨著探針類型而變化。雜交在染色體制片上進(jìn)行，雜交液濃度、pH值、雜交溫度等隨著探針DNA和染色體DNA最適退火條件而變化。1.4探針用直接標(biāo)記和間接免疫熒光法檢測檢測方法也有直接和間接之分，如果探針用直接方法標(biāo)記的可直接在熒光顯微鏡下觀察，如果探針用間接方法標(biāo)記的必須通過間接免疫熒光法進(jìn)行檢測。2染色fish的應(yīng)用2.1細(xì)胞遺傳鑒定人類有許多遺傳病和惡性腫瘤是染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目畸變引起的，因而無法用常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法進(jìn)行鑒定。而FISH的建立，不僅能為易位性重排，而且能為重復(fù)、缺失或插入性重排確定其重排類型、來源和斷裂點(diǎn)提供可靠的證據(jù)，因而在基因診斷和腫瘤分析方面具有重要意義。2.1.1fish的組織學(xué)檢測用染色體涂色或著絲粒特異性探針很容易確定人類染色體數(shù)目的異常，如X、Y、21、18、13號染色體的異常。在腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，異倍體和多倍體實屬常見，而中期分裂相又難獲得，F(xiàn)ISH更能顯示它的不凡之處。在染色體結(jié)構(gòu)異常的診斷研究中，也能提供最可靠的依據(jù)，F(xiàn)ISH也是鑒別一些環(huán)狀染色體或在額外小染色體研究中提供最可信的方法。2.1.2fish的應(yīng)用某些遺傳疾病，如:Duchenne/Becker肌營養(yǎng)不良、Miller-Dieker綜合癥和DiGeorge綜合癥等，大多數(shù)都是因為染色體微小缺失而引起的，這些病用高分辨染色體或RFLP分析方法都很難觀察到，而用FISH就很容易觀察到。同樣FISH可用于基因重復(fù)性遺傳病，如CharcotMarie-Tooth病，在17號染色體上出現(xiàn)PMP-22基因雙重雜交信號。應(yīng)用Y-特異性DNA探針，包括新近分離的SRY基因，能夠通過FISH方法診斷和研究性分化異?；蛐苑崔D(zhuǎn)，如XX男性的出現(xiàn)。分離到的DNA序列，特別是重組的Cosmid和YAC克隆，能直接通過FISH來定位，而采用多種顏色同時標(biāo)記并結(jié)合中期染色體和間期染色體方面的信息，能快速確定一系列DNA順序之間的相互次序和距離。2.3外源染色性狀的控制野生植物常有一些比較好的性狀，如抗病性、抗旱性、耐堿、耐酸等，為很多植物所缺少，而這些性狀由一些抗性基因所控制。在育種上，通常將野生種和栽培種進(jìn)行雜交，以獲得既有良好性狀，又有經(jīng)濟(jì)價值的雜種后代。因此，常常要用GISH的方法對雜種后代進(jìn)行鑒定，通過檢測信號來判斷是否有外源染色質(zhì)滲入?，F(xiàn)已有了用GISH方法對小麥雜種進(jìn)行研究的例子。2.4．基因整合度檢查FISH是檢測轉(zhuǎn)移結(jié)果和所轉(zhuǎn)基因是否表達(dá)的最直觀簡便的方法。它檢查所轉(zhuǎn)基因是否存在于受體細(xì)胞核內(nèi)，是否整合于染色體及其位置等。此外，如果使用適當(dāng)?shù)腄NA鏈為模板制備探針，那么利用這種特征可以在細(xì)胞中檢查目的RNA的存在，并推測相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄情況。3原位延伸法fps隨著標(biāo)記手段、檢測試劑以及熒光觀察等技術(shù)的發(fā)展，染色體FISH的應(yīng)用范圍已不斷拓寬。激光共聚焦顯微技術(shù)的發(fā)展，使得核的三維重建可以在計算機(jī)的輔助下得以實現(xiàn)。FISH不僅可用來定位基因，而且可用于研究基因在間核中的位置。初步的結(jié)果顯示，染色體上基因的拓樸結(jié)構(gòu)，有可能影響基因的生物學(xué)功能。FISH的進(jìn)一步發(fā)展，還將開發(fā)出穩(wěn)定有效的方法，以定位更短的基因片段（50～1000bp），使研究者們可以方便地定位來自cDNA的基因，從而加快物理圖譜與基因圖譜的繪制。一般認(rèn)為，原位延伸FISH技術(shù)，可能是有希望的候選方法。首先使短片段探針與染色體發(fā)生結(jié)合，然后在聚合酶dNTP標(biāo)記物以及其它條件下，使探針延伸，滲入標(biāo)記物，再進(jìn)行熒光檢測，因此，該方法又被稱為引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記（PRINS)。PRINS的建立將溝通細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)之間的鴻溝，為從染色體水平原位研究基因轉(zhuǎn)錄、重排、擴(kuò)增、基因組結(jié)構(gòu)與調(diào)控等諸多分子生物學(xué)課題開辟新的途徑。1.2探針標(biāo)記：探針標(biāo)記有直接和間接2種標(biāo)記法。直接標(biāo)記法是將熒光物直接標(biāo)記核苷酸上。間接標(biāo)記方