細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)課件

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述1細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)2原代細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中3原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使4原代細(xì)胞培養(yǎng)操作切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清（或離心，800－1000轉(zhuǎn)／分，5分鐘）原代細(xì)胞培養(yǎng)操作切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然5原代細(xì)胞培養(yǎng)操作組織塊培養(yǎng)法：用吸管吸取小塊，在培養(yǎng)瓶底部均勻擺開，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2－3ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)4－5h后，待組織卡能牢固貼于瓶壁，再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)3天后觀察，在組織塊邊緣是否有細(xì)胞長出，根據(jù)培養(yǎng)液顏色，適當(dāng)補(bǔ)充或更換培養(yǎng)液，10－15d可長成單層，此時(shí)，可傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)操作組織塊培養(yǎng)法：6原代細(xì)胞培養(yǎng)操作消化法：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），組織塊變松散，顏色略白時(shí)，拿出反復(fù)吹打，加入培養(yǎng)液終止消化。過濾。離心，吸去上清，（可反復(fù)一次），沉淀加入3－5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為5×105,移入培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)操作消化法：7血細(xì)胞記數(shù)板血細(xì)胞記數(shù)板8血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)：

四個(gè)角得大方格

16個(gè)中格（4＊4）原則：計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下，防止重復(fù)計(jì)數(shù)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)：原則：計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下，9公式（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝

（

四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)

×稀釋倍數(shù)×104

說明：

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

公式（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝

（

四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)10消化培養(yǎng)法的主要過程消化培養(yǎng)法的主要過程11原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長12貼壁細(xì)胞的生長規(guī)律貼壁過程貼壁細(xì)胞的生長規(guī)律貼壁過程13傳代細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增3～6次傳代細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存14培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程15（一）潛伏期（Latentphase）：細(xì)胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時(shí)間。二倍體細(xì)胞該期時(shí)間長（24-96h）連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短（10-30min）（一）潛伏期（Latentphase）：16（二）指數(shù)生長期：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitoticindex，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1-0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。（二）指數(shù)生長期：17指數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象。癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制指數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)18細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)課件19（三）停滯期：即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。（三）停滯期：20細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)課件21細(xì)胞的傳代培養(yǎng)操作1、懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用離心法后，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代2、貼壁細(xì)胞（重點(diǎn)）細(xì)胞的傳代培養(yǎng)操作1、懸浮細(xì)胞22貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)用的器材滅菌、超凈工作臺(tái)準(zhǔn)備、實(shí)際預(yù)溫、操作人員準(zhǔn)備。2、倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2～3ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)用的器材滅菌、超凈23剛加入合適過頭剛加入合適過頭244、加入1～2滴管含有血清的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。5、以1：2或1：3進(jìn)行分裝，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6、觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長情況。4、加入1～2滴管含有血清的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞25注意事項(xiàng)1．傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。2．傳代時(shí)間的掌握：每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時(shí)即可傳代。3、消化時(shí)間的掌握注意事項(xiàng)1．傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染26哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存冷凍保存要點(diǎn)凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過夜）→液氮長期保存常用細(xì)胞冷凍保存液10％DMSO＋完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）10％甘油＋完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存冷凍保存要點(diǎn)27冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)快速解凍28解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍將1－2ml凍存細(xì)胞液加入到25ml新鮮完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻離心2－3分鐘，棄上清液用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入329細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答30培養(yǎng)液pH值變化太快培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1/4圈NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度

細(xì)菌、酵母或真菌污染丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌培養(yǎng)液pH值變化太快培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊31培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌冰凍保存培養(yǎng)液將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基32培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化細(xì)菌或真菌污染丟棄培養(yǎng)物抗生素除菌培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化細(xì)菌或真菌污染33培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物培養(yǎng)液中無貼壁因子培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁胰蛋白酶消化過度34原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染35培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢由于更換不同培養(yǎng)液或血清比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。換入新鮮配制培養(yǎng)液。補(bǔ)加谷氨酰胺或生長因子培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?。試劑保存不當(dāng)血清需保存在-5℃到-20℃。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢由于更換不同培養(yǎng)液或血清36何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可何時(shí)須更換培養(yǎng)基？視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)37欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1,000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡

欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？欲回收動(dòng)38

細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？除少數(shù)特39支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察40為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。

為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH41細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞污染的種類細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源無菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞污染的種類42細(xì)菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。