原位雜交技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用

原位雜交技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用

加爾特等人和約翰riham在1969年開(kāi)發(fā)了原始染色體混合技術(shù)（ihsh）。30年后，基因和dna序列的位置可以建立在染色體上。從最初用同位素標(biāo)記探針的原位雜交技術(shù)發(fā)展形成了包括生物素原位雜交、熒光原位雜交和基因組原位雜交結(jié)合分帶技術(shù),逐漸形成了一系列較為完善的技術(shù)系統(tǒng)。本文主要介紹原位雜交技術(shù)的研究進(jìn)展及其發(fā)展前景。1非同位素原位雜交原位雜交(ISH)是利用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞或染色體的進(jìn)行雜交對(duì)細(xì)胞中的待測(cè)核酸進(jìn)行定性、定位或相對(duì)定量分析。當(dāng)進(jìn)行原位雜交時(shí),DNA分子經(jīng)過(guò)高溫處理后,雙鏈解鏈產(chǎn)生兩條單鏈,溫度下降,單鏈會(huì)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,重新形成氫鍵,恢復(fù)到原來(lái)的結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來(lái)源不同,只要它們之間的堿基序列是同源互補(bǔ)或部分同源互補(bǔ)的,就可以全部或部分復(fù)性,產(chǎn)生分子雜交。原位雜交技術(shù)經(jīng)過(guò)30年的發(fā)展,已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于動(dòng)、植物遺傳學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域中。最初的原位雜交利用同位素標(biāo)記探針,雖具有靈敏度高和對(duì)單拷貝DNA序列非常有效的特點(diǎn),但也存在放射性污染的潛在危險(xiǎn)。有些放射性同位素半衰期短,不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸,而且放射自顯影技術(shù)檢測(cè)雜交位點(diǎn)要求的照射時(shí)間長(zhǎng),需幾個(gè)周甚至幾個(gè)月。為了克服這些缺點(diǎn),科學(xué)家們發(fā)明了非同位素原位雜交技術(shù)(nonisotropicinsituhybridization,NISH),即利用非放射性同位素標(biāo)記,如生物素、熒光素、地高辛等,標(biāo)記的種類也由最初的RNA探針發(fā)展為DNA片段、基因組DNA等多種探針形式。這里主要介紹生物素標(biāo)記的原位雜交、熒光原位雜交和基因組原位雜交。1.1帶酶促標(biāo)記抗體檢測(cè)Gill和Rougburn首先將此技術(shù)應(yīng)用于植物研究。它可以用抗生素蛋白(avidin)和鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)通過(guò)親和法進(jìn)行免疫檢測(cè)。但是由于生物體內(nèi)內(nèi)源性生物素的存在,在檢測(cè)內(nèi)源性生物素含量高的樣本時(shí),會(huì)產(chǎn)生一些非特異性雜交信號(hào),以致檢測(cè)率降低。近來(lái),一種利用攜帶酶促標(biāo)記抗體對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的地高辛標(biāo)記技術(shù)也常使用。這種酶促標(biāo)記方法可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,放大雜交信號(hào),此種信號(hào)不僅不會(huì)消退,而且靈敏度高,重復(fù)性好。1.2dna的封阻與雜交ISH技術(shù)的一個(gè)重要進(jìn)步就是基因組原位雜交技術(shù)(genomicinsituhybridization,GISH)。這一技術(shù)采用取自多倍體品種或雜種的一個(gè)親本的總基因組DNA,經(jīng)標(biāo)記后作為探針,并在雜種的兩個(gè)親本親緣關(guān)系較近時(shí),用過(guò)量的來(lái)自其它親本的未標(biāo)記的總基因組DNA作為封阻,加入到雜交反應(yīng)體系中,以致來(lái)源于不同染色體組的染色體表現(xiàn)不同。過(guò)量的封阻DNA可以與其完全同源的親本DNA進(jìn)行雜交,抑制探針與非檢測(cè)親本雜交,保證大量的探針DNA能與靶染色體———待檢測(cè)的親本染色體雜交,從而出現(xiàn)很強(qiáng)的雜交信號(hào),然后對(duì)待測(cè)親本的染色體進(jìn)行分析。但是如果雜種的兩個(gè)不同染色體組是來(lái)自同一種或亞種,且大多數(shù)重復(fù)序列都具有同源性的話,則區(qū)分這兩個(gè)染色體組就變得相對(duì)困難一些。1.3小樣本全熒光標(biāo)記dutp熒光原位雜交技術(shù)(fluorecenceinsituhybridization,FISH)是利用熒光素標(biāo)記作探針。檢測(cè)時(shí),熒光素被紫外線激發(fā)放出熒光后,再在熒光顯微鏡或熒光比色計(jì)下直接觀察、檢測(cè)。近年來(lái),美國(guó)Dupont公司又生產(chǎn)出Flourescein-dUTP標(biāo)記物,可像放射性標(biāo)記物一樣直接進(jìn)行X-膠片曝光檢測(cè),使FISH的靈敏度大大提高。FISH比ISH有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)不同的探針采用不同的半抗原標(biāo)記,這可以同時(shí)檢測(cè)幾種不同熒光標(biāo)記,因而也就可以同時(shí)測(cè)定幾個(gè)不同序列在染色體上的物理順序;(2)熒光信號(hào)可以被特定的相機(jī)或激光掃描顯微鏡檢測(cè)并記錄下來(lái),因而通過(guò)數(shù)字成像顯微技術(shù)就可以獲得更為準(zhǔn)確的圖譜。雖然FISH的靈敏度很高,但是在醫(yī)學(xué)上還未達(dá)到檢測(cè)單基因及臨床診斷的水平;在植物中,多拷貝序列或高度重復(fù)序列容易檢出,但低度重復(fù)序列和單拷貝序列卻很難檢測(cè)。因此,植物熒光原位雜交技術(shù)尚應(yīng)進(jìn)一步提高探針的靈敏度,以提高單基因檢測(cè)的水平。2顯帶和n-帶技術(shù)的應(yīng)用染色體顯帶技術(shù)是一項(xiàng)借助于某些特殊的染色程序使染色體在一定部位內(nèi)顯現(xiàn)出深淺非一條帶的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。這一技術(shù)自1969年應(yīng)用于植物后,使植物的核型分析更加準(zhǔn)確,能夠正確地鑒別染色體組和單個(gè)染色體。采用核型分析比較物種之間的染色體組帶型,可以鑒別植物之間的親緣關(guān)系和由于外界因素的影響(如輻射誘變和化學(xué)誘變)所導(dǎo)致的染色體結(jié)構(gòu)上的變化,同時(shí)也可以作為遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程中細(xì)胞學(xué)鑒定的手段。但在有些情況下,只依靠顯帶尚不能識(shí)別整個(gè)染色體臂,這就使只有部分異源染色體異位的異位片段的鑒定變得困難。而原位雜交技術(shù)則使異染色質(zhì)數(shù)量和異位斷點(diǎn)的鑒定成為可能。原位雜交技術(shù)與染色體顯帶技術(shù)的結(jié)合始于70年代中期。經(jīng)過(guò)了20余年的發(fā)展,這兩種技術(shù)結(jié)合發(fā)揮了巨大作用。在人類染色體的研究中,ISH和各種染色體顯帶技術(shù)相結(jié)合已形成了一種特殊的方法;后來(lái),經(jīng)過(guò)改進(jìn)并應(yīng)用于植物研究中,使DNA序列可直接定位于經(jīng)過(guò)顯帶處理的特定的染色體區(qū)域,從而大大提高了作物遠(yuǎn)緣雜種異緣染色體檢測(cè)的精確性和可靠性。在植物中,Hutchinson和Seal采用染色體同位素原位雜交技術(shù)和C-帶方法將一個(gè)重復(fù)序列定位于特定的黑麥染色體中,但C-帶的分辨率卻大為降低。尚未見(jiàn)有關(guān)這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的更進(jìn)一步研究。為了開(kāi)發(fā)顯帶技術(shù)和ISH技術(shù)在染色體研究上的應(yīng)用,許多科學(xué)家試用了N-帶、C-帶等不同顯帶技術(shù)與ISH組合的方法。最初,在植物中是先進(jìn)行ISH或GISH,后做N-帶或C-帶分析,這樣的操作常會(huì)降低后隨的帶型分析中的條帶分辨率,因而不能得到理想的效果。爾后經(jīng)過(guò)改進(jìn)了的C-帶或N-帶/ISH技術(shù)卻能得到提供令人滿意的結(jié)果,在常規(guī)的C-帶和N-帶分析過(guò)程中,N-帶分析中熱乙酸處理和C-帶中鹽酸處理是影響隨后進(jìn)行的ISH和GISH分辨率的最主要因素。為了與隨后的ISH相結(jié)合,在采用N-帶技術(shù)和C-帶技術(shù)分別取消和改進(jìn)了熱酸處理步驟。通過(guò)改進(jìn)的N-帶和C-帶和ISH相結(jié)合,可以將多拷貝的DNA序列或基因組間易位染色體的易位點(diǎn)直接定位在特定的小麥染色體上。3原始頻散技術(shù)的應(yīng)用3.1分子圖譜和探針-pcr圖譜ISH技術(shù)是一項(xiàng)能精確檢測(cè)每個(gè)染色體上分散或成串分布的重復(fù)DNA序列的方法,大量來(lái)源于植物不同物種的重復(fù)DNA序列都可采用ISH技術(shù)進(jìn)行物理圖譜的構(gòu)建。各種重復(fù)DNA序列的物理定位可用此技術(shù)分析異染色質(zhì)的分子特性。例如,黑麥的480bp家族的各種序列(也叫做350bp家族)主要定位在黑麥的所有7對(duì)染色體的端粒區(qū)。這些位點(diǎn)與大多數(shù)C-顯帶的主要區(qū)域是相符合的。分子圖譜可以采用串聯(lián)的重復(fù)DNA序列為探針的ISH技術(shù)構(gòu)建。特定染色體上獨(dú)特的ISH圖譜是鑒定染色體的又一種方法。例如,由于120bp重復(fù)DNA序列家族廣泛存在于黑麥的染色體中,這就為幾個(gè)Triceae種的染色體提供了獨(dú)特的ISH圖譜。黑麥中所有來(lái)源于B染色體組和幾個(gè)來(lái)源于A、D染色體組的染色體都能用120bp序列為探針的ISH技術(shù)鑒定出來(lái)。ISH技術(shù)可用于多拷貝基因家族的圖譜制作。例如植物的5S和18S、26S核糖體基因。采用ISH分析,人們?cè)谛←満痛篼溨袡z測(cè)出幾個(gè)5S、18S、26SrRNA基因的新位點(diǎn)。3.2染色體上靶細(xì)胞的定位多年來(lái),許多實(shí)驗(yàn)室都為提高植物非同位素ISH對(duì)單或低拷貝DNA序列定位的靈敏度作了努力。這幾年,雖然曾有一系列關(guān)于玉米、豌豆、大麥、苜蓿和水稻等植物低或單拷貝基因定位的報(bào)道,但這些實(shí)驗(yàn)中采用的染色體上靶序列的長(zhǎng)度基本上都大于10kb。也有是小到0.7kb的序列定位的,但是檢測(cè)信號(hào)的成功頻率非常低(在觀察到的中期細(xì)胞中只見(jiàn)到6%的細(xì)胞有1個(gè)或多個(gè)信號(hào)),而且這些信號(hào)只有在單個(gè)的染色單體中才檢測(cè)到。在如此低的檢測(cè)頻率和并沒(méi)有對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)檢查的情況下,區(qū)分一個(gè)真實(shí)的信號(hào)和一個(gè)人為的或背景所造成的假象是很困難的。例如Clark將大麥醇溶蛋白基因定位于第號(hào)染色體近中心粒的短臂處,檢測(cè)頻率只有2.5%,而Lehfer等認(rèn)為,大麥醇溶蛋白基因事實(shí)上位于第5號(hào)染色體短臂的遠(yuǎn)端。這種矛盾的報(bào)道很可能是Clark并沒(méi)有將真實(shí)的雜交信號(hào)鑒定出來(lái)之故。3.3小麥染色體的制備GISH利用基因組總DNA為探針與雜種進(jìn)行原位雜交,可以有效地將同源性比較接近的兩個(gè)染色體組(如同一屬內(nèi)的不同種之間)區(qū)分開(kāi)來(lái)。這樣GISH就可以用于配對(duì)染色體的分析,從而進(jìn)行染色體組配對(duì)的研究。一般常規(guī)的減數(shù)分裂分析很難將配對(duì)的和來(lái)自不同基因組的染色體區(qū)分開(kāi),所以GISH就成了傳統(tǒng)的染色體組分析的必要補(bǔ)充技術(shù)。GISH技術(shù)還成功地用于異源多倍體品種染色體結(jié)構(gòu)的分析。GISH利用多倍體的2倍體祖先種的染色體組DNA為探針,可以提供有關(guān)染色體組進(jìn)化和異源多倍體品種分化等重要信息。鐘少斌等采用生物素標(biāo)記的簇毛麥基因組為探針與小麥-簇毛麥雜種雙二倍體進(jìn)行雜交,獲得的原位雜交效果較好,且標(biāo)記的簇毛麥與Wright染色液染色的小麥染色體之間反差很大,用此方法不僅檢測(cè)出了小麥-簇毛麥雜種中整個(gè)簇毛麥基因組,而且還檢查出附加或取代小麥染色體中的個(gè)別簇毛麥染色體。在植物育種中,與野生種進(jìn)行雜交可以引入含有有用基因的外源染色體片段,這對(duì)植物的良種繁育來(lái)說(shuō)是一個(gè)很有價(jià)值的方法。比如,Rajaram等采用此法就曾將黑麥1R染色體短臂上帶有的數(shù)個(gè)抗病基因?qū)氲皆S多高產(chǎn)的小麥栽培種中。在許多檢測(cè)外源染色質(zhì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)中,GISH技術(shù)是最為有效而精確的一種。它可以估計(jì)易位系中外源染色體的總數(shù),并且采用高度分散的物種所特有的重復(fù)DNA序列作探針,檢測(cè)易位染色體上的斷裂位點(diǎn)另外采用與分帶相結(jié)合的技術(shù),還可以估計(jì)外源染色體片段的長(zhǎng)度和失去的小麥染色體片段的長(zhǎng)度。馬有志等以生物素(Biotin-16dUTP)標(biāo)記天蘭冰草基因組DNA作探針和非標(biāo)記的普通小麥品種中國(guó)春的基因組DNA作封阻,與遠(yuǎn)中2號(hào)體細(xì)胞中期染色體DNA進(jìn)行原位雜交的結(jié)果表明,遠(yuǎn)中2號(hào)有1對(duì)兩臂末端部分是來(lái)自天蘭冰草的小麥染色體和5對(duì)天蘭冰草的染色體。3.4h.volga-afrcamum雜交的細(xì)胞中具有特定的空間分布GISH還可以用于研究種間雜種不同染色體組的染色質(zhì)分布[,33]大麥(Hordeumchinense)×黑麥(Secaleafricanum)雜種分裂期間核的分析表明,來(lái)源于不同親本染色體組的染色質(zhì)并沒(méi)有混合在一起,而是分布在核的不同區(qū)域。同樣,在H.vulgare×S.africamum雜交種的整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)也觀察到相類似的有關(guān)親代基因組相分離的現(xiàn)象。這些結(jié)果證實(shí)了Bennet研究大麥×黑麥雜種時(shí)提出的假說(shuō),即在自然多倍體或人工多倍體中,不同染色體組在細(xì)胞內(nèi)具有特定的分布和空間排列結(jié)構(gòu),這種空間分布與其基因表達(dá)密切相關(guān)。同樣Leitch等在小麥外源染色體附加系和易位系中也觀察到相似的情況。4優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟,提高是否綜上所述,我們認(rèn)為以下問(wèn)題值得探討:(1)NISH技術(shù)分辨率的提高。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,NISH已從只能應(yīng)用于多線染色體重復(fù)DNA序列和擴(kuò)增序列的檢測(cè),發(fā)展到對(duì)單拷貝DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。采用熒光顯微技術(shù)和圖像處理技術(shù)可使雜交結(jié)果更為清晰、準(zhǔn)確。但對(duì)NISH來(lái)說(shuō),最重要的是其分辨率的提高。目前,許多實(shí)驗(yàn)室都還不能對(duì)小于10kb的靶細(xì)胞DNA序列建立圖譜,這對(duì)NISH在植物染色體圖譜構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用是主要的限制因素。與在人類染色體上的應(yīng)用相比導(dǎo)致植物染色體非同位素分辨率相對(duì)比較低的因素主要有三:植物細(xì)胞壁和細(xì)胞中碎片的存在、中期染色體的濃縮度過(guò)大以及缺少對(duì)整個(gè)雜交過(guò)程中各步進(jìn)行優(yōu)化的細(xì)致研究。為此,今后必須對(duì)某些實(shí)驗(yàn)步驟加以改進(jìn),提高切片的制作質(zhì)量和雜交程度,以減小DNA的損失和雜交不充分給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的影響,并且將ISH與其他分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái),提高檢測(cè)單拷貝或低拷貝序列的靈敏度。(2)間期制圖。植物的中期染色體比人體中期染色體的濃縮度大,這就給以低拷貝探針進(jìn)行ISH帶來(lái)了很大困難。在間期階段,如果染色體解濃縮,靶細(xì)胞濃縮度減小,這就可以提高原位雜交的分辨率,進(jìn)而增加分子圖譜的準(zhǔn)確性和精確性。比如,在人體中期染色體上,ISH只能檢測(cè)出相距1Mb以上的兩個(gè)探針的雜交信號(hào)。而當(dāng)兩個(gè)探針的雜交距離小于1Mb時(shí),在中期的染色體上這兩個(gè)探針的信號(hào)會(huì)成為一個(gè)點(diǎn),即使間期核內(nèi)DNA序列之間距離小到50kb仍可以檢測(cè)出來(lái)。(3)連鎖關(guān)系的細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定。遺傳連鎖和各個(gè)染色體之間關(guān)系的細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定是分子和細(xì)胞生物學(xué)的主要工作內(nèi)容之一。傳統(tǒng)的確定一個(gè)染色體和一個(gè)特定的連鎖群之間的關(guān)系主要依靠對(duì)非整倍體的分析,比如對(duì)三體染色體的研究。但這些非整倍體的原種非常難以保持,而且并不是所有的栽培品種都能獲得三體種子。隨著ISH的應(yīng)用,現(xiàn)在已逐步建立了一整套對(duì)遺傳連