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文檔簡介
植物中糖與糖醇乙?;苌臍庀嗌V分離和質(zhì)譜鑒定
單糖、雙糖和雙醇廣泛存在于自然界的各種生物中。植物體內(nèi)的糖醇具有提供能量、清除多余自由基和調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓從而提高植物抗逆性等生理功能(Loescher,1987)。許多學(xué)者試圖闡明糖醇類物質(zhì)與植物抗逆性的相關(guān)性及其作用機理。但是植物組織中糖醇類物質(zhì)濃度相對較低,采用一般的粗測定的方法很難得到其準(zhǔn)確含量,因而很有必要建立一種快速且靈敏的糖醇類物質(zhì)分析方法。采用毛細(xì)管氣相色譜法測定糖與糖醇具有速度快、分離效果好以及靈敏度高等優(yōu)點。在氣相色譜分析之前,需將糖與糖醇制備成易揮發(fā)且熱穩(wěn)定的衍生物。常用的衍生化方法有三甲基硅烷化(TMS)、甲基化和乙酰化,這3種方法各有利弊。TMS化方法簡便,成本低廉,但其衍生化產(chǎn)物分子量大,往往會影響分離效果(蘇桂琴等,1988)。而且TMS化對無水條件要求較高,產(chǎn)物極易水解。糖與糖醇甲基化衍生是可行的,但分析特異性低,對于某些物質(zhì)的分離效果不理想(方一葦,1994)。糖和糖醇經(jīng)乙?;蠓肿恿窟m中,對一些常見的糖類物質(zhì)均能有效分離,但目前在制備糖腈乙酯時人們多用吡啶作溶劑,反應(yīng)耗時太長(李鐵林等,1981)。用1-甲基咪唑作溶劑和催化劑,衍生化反應(yīng)僅需10min即可結(jié)束(Chenetal.,1981),而且花費不高,前人在不同衍生化條件下應(yīng)用過此法(Chenetal.,1981;王慧中等,2000),但對于該衍生化方法的最佳反應(yīng)條件還未見報道。本研究以葡萄糖、甘露醇、山梨醇和核糖醇為標(biāo)準(zhǔn)樣品對該乙?;磻?yīng)條件進(jìn)行對比研究,試圖確定該方法的最佳反應(yīng)條件,并擬定適用于微量植物樣品中多種糖與糖醇的快速、準(zhǔn)確的定性和定量分析方法。1材料和方法1.1糖和糖醇標(biāo)準(zhǔn)物使用的試劑有1-甲基咪唑(sigma公司)、鹽酸羥胺、乙酸酐和無水硫酸鈉(R.A)。糖和糖醇標(biāo)準(zhǔn)物為D-葡萄糖(Glu)、甘露醇(Man)、D-山梨醇(Sor)和核糖醇(Rib),以上標(biāo)準(zhǔn)物均為分析純。器材包括真空濃縮儀、VarianCP-3800型氣相色譜儀、VOYAGER氣相色譜-質(zhì)譜儀和微量注射器等。1.2反應(yīng)條件之列糖類的乙酰化衍生,實質(zhì)經(jīng)歷了兩步反應(yīng):肟化反應(yīng)和乙?;磻?yīng),不同的肟化反應(yīng)條件、乙酰化反應(yīng)條件、各組分間的相互作用及用量多少均屬反應(yīng)條件之列。1.2.1l-1-甲基咪唑的合成為了獲得肟化反應(yīng)的最佳溫度和反應(yīng)時間,分別在室溫、50℃和80℃條件下反應(yīng)2、5、10、20min或更長時間,試驗方法如下:取16支小玻璃管,每一小管中均用微量進(jìn)樣器加入0.4mg.mL-1甘露醇和葡萄糖水溶液各10礚,混勻后真空濃縮干燥,加入鹽酸羥胺溶液(1-甲基咪唑為溶劑,100mg.mL-1)25礚,其中8支在室溫條件下分別反應(yīng)2、5、10、20、30、60、120和720min,4支放入50℃水浴中分別反應(yīng)2、5、10和20min,4支放入80℃水浴中分別反應(yīng)2、5、10和20min,各管反應(yīng)到達(dá)預(yù)定時間之后分別加入25μL乙酸酐,混勻,室溫反應(yīng)5min,用200μL氯仿萃取產(chǎn)物,500μL水洗3~4遍,最后用無水硫酸鈉吸去殘余水分。取適量混合衍生化產(chǎn)物和適量內(nèi)標(biāo)混勻,封裝于毛細(xì)管中,保證內(nèi)標(biāo)終濃度為0.01mg.mL-1。1.2.2鹽酸羥胺溶液制備取6支小管,每一小管中均用微量進(jìn)樣器加入0.4mg.mL-1甘露醇和葡萄糖水溶液各10μL混勻后真空濃縮干燥,加入鹽酸羥胺溶液25μL,放入80℃水浴5min;取出后加入乙酸酐,其中一管加入乙酸酐混勻后立即加入200μL氯仿,其余5管分別反應(yīng)3、5、10、20和30min后再加氯仿提取,水洗后用無水硫酸鈉干燥,加適量內(nèi)標(biāo)(0.01mg.mL-1)封裝于毛細(xì)管中。1.2.3糖、糖醇的衍生化為了解各反應(yīng)物之間在衍生化反應(yīng)過程中是否存在相互影響或競爭作用,取5支小玻璃管,按表1分別加入糖或糖醇樣品,葡萄糖、甘露醇和山梨醇水溶液濃度均為0.4mg.mL-1,抽真空濃縮干燥后分別加入25μL鹽酸羥胺溶液,80℃水浴5min,取出加25μL乙酸酐反應(yīng)5min,200μL氯仿萃取衍生化產(chǎn)物,此后操作同上。1.2.4分組用量相同為確定該衍生化方法的最佳糖與糖醇用量,取9支小玻璃管均加入葡萄糖、甘露醇和山梨醇3個組分,各管中樣品用量(各組分用量相同)分別為0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256和0.512mg。分別加入25礚鹽酸羥胺,80℃水浴5min,取出加25μL乙酸酐反應(yīng)5min,均用200μL氯仿提取,水洗后加適量內(nèi)標(biāo)(0.01mg.mL-1)混勻封裝于毛細(xì)管中,用于氣相色譜分析。1.3初始溫度條件美國Varian公司CP-3800型氣相色譜儀,F(xiàn)ID檢測器,檢測器溫度為300℃,進(jìn)樣器溫度為250℃,BP-15柱(30m×0.25mm×0.25μm),N2、H2和空氣氣壓均為16psi,初始溫度50℃,15℃.min-1升溫到220℃,保留3min,25℃.min-1升溫到280℃,保留10min。VOYAGERGC/MS儀,TRACEGC儀,檢測器溫度為300℃,進(jìn)樣器溫度為250℃,BP-15柱(30m×0.25mm×0.25μm),載氣He0.8mL.min-1,初始溫度50℃,20℃.min-1升溫到200℃,10℃.min-1升溫到280℃,保留10min。1.4衍生化產(chǎn)物的制備取植物鮮樣0.02~0.5g,加入0.02mg內(nèi)標(biāo),液氮研磨成細(xì)碎粉末或加少許石英砂研磨至勻漿,加入1~4mL碳水化合物抽提液(甲醇:氯仿:水=12:5:3)(Tarczynskietal.,1992;王慧中等,2000),隨后加入等體積水,混勻,靜置片刻,將上清液過濾轉(zhuǎn)入濃縮瓶中,抽真空濃縮至干,待其冷卻后加少許1-甲基咪唑懸浮。加入0.1mL鹽酸羥胺溶液,混勻80℃水浴5min,取出加入0.15mL乙酸酐,混勻室溫反應(yīng)5min,加入1mL氯仿萃取衍生化產(chǎn)物,然后用二倍體積水洗3~4遍,用無水硫酸鈉吸去殘余水分后,直接封裝于毛細(xì)管中,待測。用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(氣質(zhì)聯(lián)用GC-MS)定性,用毛細(xì)管氣相色譜法定量。定量時,以核糖醇為內(nèi)標(biāo),分別作甘露醇、山梨醇和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)標(biāo)在進(jìn)樣前一刻加入。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及最后的樣品中目的物定量,直接借助于Agilent公司提供的分析軟件。2結(jié)果與分析2.1衍生化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)測定按王慧中等(2000)所使用的方法將各樣品衍生化,加入內(nèi)標(biāo),進(jìn)行氣相色譜分析,驗證其分離效果,然后用GC-MS進(jìn)行定性分析,測定衍生化產(chǎn)物結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖1~圖6。從圖中可以看出各組分均能很好地分離,其中甘露醇和山梨醇是同分異構(gòu)體,二者仍能完全分離。從各檢出物質(zhì)譜圖及其結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果可知糖的醛基經(jīng)肟化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成腈基,糖和糖醇的各個羥基均被乙?;〈f明衍生化完全,該方法可行。因毛細(xì)管氣相色譜和GC-MS升溫程序稍有出入,故二者保留時間不一致,GC-MS出峰時間大約提前2.5min。2.2誘導(dǎo)條件試驗2.2.1衍生化反應(yīng)進(jìn)程將室溫下不同肟化時間處理后得到的衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間短的除各樣品對應(yīng)的峰外,在13.724處增加了一種檢出物,而反應(yīng)時間長的出現(xiàn)的峰數(shù)與所加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)相符,且保留時間與2.1結(jié)果相同(圖7和圖8)。為確定該多余檢出物的結(jié)構(gòu),另將此樣品進(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果如圖9和圖10。從質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖可以看出,13.724處檢出物是葡萄糖未經(jīng)肟化而直接進(jìn)行乙酰化的產(chǎn)物,充分說明這是肟化反應(yīng)進(jìn)行不完全的結(jié)果。不同肟化時間處理結(jié)果(圖11)表明,室溫下肟化反應(yīng)在30min以前均有不完全反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生,30min以后反應(yīng)完全,且達(dá)到平衡。對50℃水浴中不同肟化時間處理所得衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果(表2)表明,在50℃條件下進(jìn)行肟化反應(yīng),2min以后即能反應(yīng)完全,10min時衍生化效果最好,但此時反應(yīng)未達(dá)平衡,約20min時反應(yīng)穩(wěn)定。80℃水浴中不同肟化時間處理后,衍生化產(chǎn)物氣相色譜分析結(jié)果(表3)表明,在80℃條件下肟化反應(yīng)能迅速完成,且很快即能達(dá)到平衡。綜合上述實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論:室溫下肟化反應(yīng)耗時太長,而且衍生化效率很低;50℃水浴中反應(yīng)速度較快,能在10min內(nèi)達(dá)到最高衍生化效率,但反應(yīng)不夠穩(wěn)定,時間稍短可能達(dá)不到最佳反應(yīng)效果,時間稍長反應(yīng)即向反方向進(jìn)行,約在20min左右反應(yīng)方可達(dá)到平衡;80℃水浴中反應(yīng)2min內(nèi)即能達(dá)到平衡,且反應(yīng)完全,5min時反應(yīng)更趨穩(wěn)定,為節(jié)省時間,減小實驗誤差,擬采用80℃水浴5min作為最佳肟化條件。2.2.2糖與糖醇的乙酰化反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積及時間將肟化后的糖與糖醇進(jìn)行不同時間的乙?;幚恚玫降难苌a(chǎn)物經(jīng)氣相色譜分析后所得結(jié)果如圖12所示。結(jié)果顯示,3min時糖與糖醇的乙?;磻?yīng)產(chǎn)物峰面積達(dá)到最大值,3min后開始降低,5min后幾乎持平。所以為保證各次反應(yīng)較好的重復(fù)性,減小實驗誤差,加入乙酸酐后最佳反應(yīng)時間為5min。2.2.3糖或糖醇組分的衍生化效果不同組分組合衍生化反應(yīng)結(jié)果(表4)表明,各組分之間有協(xié)同衍生化反應(yīng)的作用,即糖或糖醇組分越多,衍生化效果越好。在含葡萄糖的多組分樣品中,各組分衍生化效率比不含葡萄糖的樣品高12%左右。分析其原因可能是各組分分子之間產(chǎn)生相互作用促進(jìn)肟化或乙酰化反應(yīng);或某一糖分的反應(yīng)產(chǎn)物可作為另一組分肟化或乙?;拇呋瘎?。2.2.4反應(yīng)物用量對衍生化反應(yīng)的影響各反應(yīng)體系中鹽酸羥胺和乙酸酐用量均相同,根據(jù)反應(yīng)式和各物質(zhì)分子量計算,當(dāng)葡萄糖、甘露醇和山梨醇同時存在,且用量均達(dá)0.512mg時,25礚鹽酸羥胺和25礚乙酸酐仍能使其反應(yīng)完全。由圖13可以看出各組分用量低于0.256mg時,衍生化產(chǎn)物峰面積隨反應(yīng)物用量增大而接近成比例增加,用量大于0.512mg時衍生化產(chǎn)物峰面積顯著降低。由此可見,在肟化試劑和乙?;噭┐蟠筮^量時,參與反應(yīng)的糖與糖醇量不影響衍生化效率,但糖與糖醇的量接近理論上完全反應(yīng)所需糖與糖醇用量時,衍生化反應(yīng)明顯被抑制,因為衍生化產(chǎn)物增加會促進(jìn)反應(yīng)向逆方向進(jìn)行。進(jìn)一步分析曲線的線性相關(guān)性可知,參與反應(yīng)的糖與糖醇的用量不宜超過理論上與衍生化試劑完全反應(yīng)所需量的1/2。2.3相關(guān)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線本方法以核糖醇為內(nèi)標(biāo),分別作甘露醇、山梨醇和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,以此對樣品中相應(yīng)組分進(jìn)行定量分析。與一般采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線校正法所不同的是,做校準(zhǔn)曲線時,進(jìn)樣前加入同等濃度的內(nèi)標(biāo),這樣可以將因進(jìn)樣量和進(jìn)樣手法引起的誤差降低到最低限,結(jié)果可以得到非常理想的校準(zhǔn)曲線。實驗所用的氣相色譜儀噪音峰高為14μV,系統(tǒng)確認(rèn)3倍峰高為各物質(zhì)最小檢測量,根據(jù)最佳衍生化條件下各組分所出峰高和樣品濃度、進(jìn)樣量和分流比計算出甘露醇、山梨醇和葡萄糖的最低檢測量分別為2.49×10-11、2.94×10-11和4.04×10-11g。圖14的上圖所示為對照毛白楊植株莖中糖與糖醇?xì)庀嗌V分析結(jié)果,其葡萄糖、甘露醇和山梨醇含量分別為0.31、0.08和0.004mg.gwf-1;圖14的下圖所示為轉(zhuǎn)基因毛白楊根中糖與糖醇?xì)庀嗌V分析結(jié)果,其葡萄糖和甘露醇含量分別為0.33和0.30mg.gwf-1,山梨醇含量幾乎為0。經(jīng)質(zhì)譜鑒定圖14的下圖中未標(biāo)記的主要幾個峰分別為肌醇、肌醇的同分異構(gòu)體和蔗糖等,如果做相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,同樣可以對其進(jìn)行定量分析。關(guān)于轉(zhuǎn)基因植株和對照植株糖醇含量差異及其分析將另文報道。3最佳乙?;瘲l件的確定經(jīng)過以上一系列衍生化條件試驗得出,用1-甲基咪唑作為溶劑和催化劑對糖與糖醇進(jìn)行乙?;苌淖罴央炕瘲l件為80℃水浴5min,最佳乙?;瘲l件為室溫反應(yīng)5min,而且實驗結(jié)果顯示參與反應(yīng)的各糖與糖醇之間存在正向促進(jìn)作用,組分越多越利于衍生化反應(yīng)的進(jìn)行,但參與反應(yīng)的糖與糖醇用量不宜超過理論上與肟化及乙酰化試劑完全反應(yīng)所需量的1/2,否則衍生化反應(yīng)會受到抑制,衍生化效率降低。實際應(yīng)用表明,采用該方法對植物組織中糖與糖醇進(jìn)行衍生化,用毛細(xì)管氣相色譜法分離,內(nèi)標(biāo)法定量,能得到理想的分離和定量效果。4使用范圍及應(yīng)用前景該實驗所應(yīng)用的衍生化方法經(jīng)歷了肟化和乙?;瘍刹椒磻?yīng)。肟化反應(yīng)相對較復(fù)雜,需在一定溫度條件下才能順利向正反應(yīng)方向進(jìn)行,且反應(yīng)持續(xù)的時間要恰到好處,時間太短,肟化不完全或反應(yīng)未達(dá)平衡,時間太長,會影響實驗進(jìn)程。乙?;磻?yīng)是一放熱過程,對溫度要求不高,加入乙酸酐后室溫下反應(yīng)5min即可。在前后短短的10min反應(yīng)之內(nèi),實質(zhì)包括多個化學(xué)反應(yīng),其中任何一個中間產(chǎn)物受到外界干擾都會對衍生化反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的影響,這也是多種糖與糖醇同時參與反應(yīng)時會提高衍生化效率的主要原因。當(dāng)然,在一定溫度條件下,各步反應(yīng)都存在固定的反應(yīng)平衡常數(shù),因而參與反應(yīng)的糖與糖醇用量存在一適宜的范圍。本研究擬定的使用范圍是根據(jù)實驗結(jié)果較粗略地確定的,適于一般的應(yīng)用型研究,對于基礎(chǔ)的化學(xué)理論
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