甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯b抗血小板聚集和釋放作用研究

甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯b抗血小板聚集和釋放作用研究

與血栓形成和血栓形成直接相關(guān)的血栓活動(dòng)因素為paf。這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的血小板聚集誘導(dǎo)劑。研究表明銀杏內(nèi)酯B(GB)是血小板活化因子特異性受體拮抗劑,然而GB水溶性極小,臨床使用受限。為使GB在治療血栓性疾病方面有更廣泛的應(yīng)用,我們?cè)贕B母核上增加新的基團(tuán)合成衍生物甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B,增加了水溶性,見結(jié)構(gòu)式圖。本試驗(yàn)旨在考察甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)血小板聚集和釋放反應(yīng)的影響,探討其治療血栓性疾病的特點(diǎn)及作用機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藥物、試劑和儀器甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B,白色結(jié)晶(純度>98%,分子量為591.63g/moL),由南京柯菲平醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司提供,用生理鹽水配制。銀杏內(nèi)酯B(GB),白色結(jié)晶(分子量為424.4g/moL),購(gòu)自合肥標(biāo)品生物技術(shù)有限公司,用二甲基亞砜配制。曲克蘆丁注射液:天津藥業(yè)焦作有限公司。血小板活化因子(PAF):SIGMA公司。鈣離子指示劑Fluo-3-AM:Ivitrogen公司。TXB2放免試劑盒,6-keto-PGF1α放免試劑盒,購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。1.1.2動(dòng)物♂性新西蘭家兔,由南京江寧縣湯山青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2002-0027。1.1.3血小板聚集及血凝儀測(cè)定FA-2104上皿電子天平(上海精科天平)。LDZ5-2離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。XSP-13型光學(xué)顯微鏡(南京江南光學(xué)儀器廠)。PAPER-I型血小板聚集及血凝測(cè)定儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)。ZT-Ⅲ多頭細(xì)胞樣品收集器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。SpectraMaxue5f8GeminiXS微孔板熒光檢測(cè)儀(MolecularDevices公司)。DFM-96型16管放射免疫γ計(jì)數(shù)器(合肥眾成機(jī)電技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1血小板prp測(cè)定取♂性家兔48只,體重2.0~2.5kg,隨機(jī)分為6組:(1)對(duì)照組:0.9%氯化鈉注射液。(2)曲克蘆丁組:24mg/kg。(3)GB組:3.90mg/kg。(4)甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅠ組:1.95mg/kg。(5)甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅡ組:3.90mg/kg。(6)甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅢ:7.80mg/kg。耳緣靜脈連續(xù)給藥5d,給藥容積均為0.5mL/kg。末次給藥15min后頸總動(dòng)脈取血,用3.8%檸檬酸鈉抗凝,血液與檸檬酸鈉容積之比為9∶1。800r/min離心10min后吸取上層血漿即得PRP。將剩余血液2500r/min離心10min后吸取上層血漿即得貧血小板血漿(PPP)。對(duì)PRP進(jìn)行計(jì)數(shù),若血小板濃度較高,則用PPP稀釋至360×109/L。先用250μLPPP進(jìn)行定標(biāo),然后取250μLPRP加入測(cè)試杯中,在37℃預(yù)溫槽中預(yù)熱1min后放入測(cè)試孔,按“開始”鍵時(shí)立即加入誘導(dǎo)劑0.01mg/mLPAF10μL,測(cè)定最大聚集率,每只家兔同時(shí)測(cè)定4個(gè)測(cè)試孔取均值。用公式計(jì)算血小板聚集抑制率。1.2.2甲基丙烯酸酯b對(duì)paf誘導(dǎo)寄生蟲釋放的影響各組末次給藥后15min取血,制備PRP和PPP,進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。1.2.2.混懸血小板的制備(1)Flou-3-AM導(dǎo)入血小板:在4mLPRP中加入4μLFlou-3-AM(Flou-3-AM用DMSO溶液配成1mg/mL)置37℃30min,用Hepes緩沖液洗滌二次(800r/min離心10min,加入等體積Hepes緩沖液進(jìn)行沖洗),混懸血小板(濃度大約為150×109/L)在Hepes緩沖液中待測(cè)。(2)熒光測(cè)量:取上述負(fù)載Flou-3血小板懸液在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為505nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm),計(jì)算血小板[Ca2+]i。1.2.2.txb2和6-keto-pgf1水平放射免疫法(RIA)測(cè)定PAF誘導(dǎo)家兔血小板中TXA2和PGI2含量。由于TXA2和PGI2在37℃下性質(zhì)不穩(wěn)定,很快水解為穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α,因此可測(cè)定TXB2和6-keto-PGF1α的含量來反映TXA2和PGI2的水平。取血小板數(shù)為360×109/LPRP500μL,加20μL0.01mg/mLPAF反應(yīng)5min后,立即加入20μL10μmol/L消炎痛終止反應(yīng)。然后離心(1200r/min,5min),取上清400μL于-20℃保存,按RIA試劑盒說明書測(cè)定TXB2和6-keto-PGF1α含量。2結(jié)果2.1對(duì)paf誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率的影響甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3個(gè)劑量組、GB3.90mg/kg組和曲克蘆丁24mg/kg組對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率有抑制作用,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。2.2甲基丙烯酸酯b對(duì)paf誘導(dǎo)寄生蟲釋放的影響2.2.1組血小板釋放ca2+、空白對(duì)照率的影響甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3個(gè)劑量組對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+均有抑制作用,在激發(fā)后10min內(nèi)與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。曲克蘆丁(24mg/kg)和GB(3.90mg/kg)對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+有抑制作用,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表2。2.2.2甲磺酸胺銀杏內(nèi)b7的影響甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3個(gè)劑量組對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放TXB2有抑制作用,并可降低TXB2/6-keto-PGF1α比值,其中甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B7.80mg/kg劑量組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表3。3甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯b的生理作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有抑制作用,能減少血小板釋放Ca2+、TXB2,降低TXB2/6-keto-PGF1α比值。以上研究中,我們選取了曲克蘆丁和GB這兩個(gè)陽性對(duì)照藥。既住研究發(fā)現(xiàn),曲克蘆丁體內(nèi)給藥對(duì)PAF、ADP、AA、COL有抑制作用。曲克蘆丁系蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮化合物,能夠增加紅細(xì)胞和血小板表面電荷密度,抑制紅細(xì)胞和血小板聚集,加強(qiáng)體內(nèi)纖維蛋白溶解活性。而GB是甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B的前體藥物,在血小板聚集和釋放反應(yīng)中,甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B與GB具有相似的藥理活性,均能抑制血小板聚集,抑制血小板釋放Ca2+、TXB2等活性物質(zhì)。由于甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B增加了水溶性,若作為新藥注射液開發(fā)具有一定的市場(chǎng)前景。Ca2+是血小板代謝與功能的一個(gè)重要因子,它參與血小板激活的許多重要環(huán)節(jié),包括形狀變化、聚集和釋放。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的平衡主要由細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流決定。細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的調(diào)節(jié)有兩個(gè)最經(jīng)典的通道,三磷酸肌醇(IP3)信號(hào)調(diào)節(jié)通路和Ryanodine信號(hào)調(diào)節(jié)通路。本研究中,PAF激活膜磷脂酶C,催化磷脂酰肌醇水解,產(chǎn)生二脂酰甘油和三磷酸肌醇促使Ca2+由血小板內(nèi)的致密管道系統(tǒng)釋放,并促使Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致血小板內(nèi)游離Ca2+濃度升高進(jìn)而觸發(fā)其聚集和釋放功能,使血液循環(huán)障礙進(jìn)一步發(fā)展。甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可以抑制對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板釋放Ca2+。由于GB是PAF受體特異性拮抗劑,因此推測(cè),甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可能通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制PAF與PAF受體的結(jié)合,從而降低PAF誘導(dǎo)家兔血小板Ca2+的釋放。TXA2是血小板活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑,也是一種致血管收縮和平滑肌細(xì)胞分裂的生物活性物質(zhì)。主要由血小板合成,但也可以由單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)合成。PGI2是