廣西莪術(shù)揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms指紋圖譜對(duì)藥效貢獻(xiàn)的研究

廣西莪術(shù)揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms指紋圖譜對(duì)藥效貢獻(xiàn)的研究

廣西莪術(shù)是2010年版《中國(guó)藥典》中收集的三種基原茂分術(shù)（curcumapha相應(yīng)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化）的一種，即c.k胡說(shuō)八道。etc.f.liang和wenyunikc.wenyunik）中的一種。這是姜科江黃種植物的干燥生根。莪術(shù)的主要有效部位為根和根莖,揮發(fā)油是莪術(shù)的主要活性成分。文獻(xiàn)報(bào)道莪術(shù)油具有抗癌、抗凝血、抗氧化和保肝等作用,其中莪術(shù)醇、β-欖香烯、莪術(shù)酮、莪術(shù)二酮是莪術(shù)的主要抗腫瘤活性成分。目前對(duì)于莪術(shù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)多以化學(xué)成分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),沒(méi)有將化學(xué)成分組或者“有效組分群”與藥效結(jié)合起來(lái),而中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有整體性、模糊性的特征,是有效物質(zhì)群綜合效應(yīng)結(jié)果。因此,本文在已發(fā)表的廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜基礎(chǔ)上,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),研究莪術(shù)油對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的生長(zhǎng)抑制作用,尋找與莪術(shù)抗腫瘤作用相關(guān)的“有效組分群”,尋找不同產(chǎn)地的廣西莪術(shù)揮發(fā)油與化學(xué)特征指紋峰之間的關(guān)系,以闡明廣西莪術(shù)抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1材料表面1.1儀器、試驗(yàn)裝置5973N-6890型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司),色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱(美國(guó)Agilent公司);FA1004型電子天平(海精科天平儀器廠),調(diào)溫加熱器(上海電理儀器廠),ThermoCO2孵箱(美國(guó)Thermoscientificcompany),Olympus倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),Bio-TEK酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio公司),電泳槽(美國(guó)Bio-RAD公司),GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)基Hochest33342(凱基生物公司),四唑鹽(MTT)(美國(guó)Amresco公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司),細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI1640(Gibco公司),胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司),一抗及二抗(北京中衫金橋生物公司),其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。CNE-2細(xì)胞株為本科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心傳代保株。1.3樣品采集和儲(chǔ)藏廣西莪術(shù)樣品分別于2007年1月采自靈山、貴港、橫縣3個(gè)主產(chǎn)區(qū),其中靈山共采4批次、貴港和橫縣各采3批次,共計(jì)10個(gè)批次,樣品編號(hào)依次為1~10。樣品采收后洗凈、切片、曬干、打碎,過(guò)20目篩,干燥器儲(chǔ)藏備用。所有樣品經(jīng)本教研室鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)C.kwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang。2方法和結(jié)果2.1廣西桂術(shù)揮發(fā)油gc-ms指紋譜2.1.1掃描溫度lmHP-5MS毛細(xì)管柱(0.25μm×250μm×30.0m),載氣為高純氦氣,流速1.0mL·min-1,進(jìn)樣量1μL,程序升溫:65℃恒溫2min,65~90℃(5℃·min-1)恒溫3min,90~103℃(20℃·min-1)恒溫3min,103~150℃(8℃·min-1)恒溫15min,150~280℃(20℃·min-1);不分流,進(jìn)樣溫度250℃,進(jìn)樣量1μL,倍增器電壓1435V,接口溫度280℃,離子源溫度230℃,電離方式EI;電子能量70.1eV;溶劑延遲3min,掃描質(zhì)量范圍m/z45~550。在此色譜條件下,各特征能有效分離。2.1.2gc-ms指紋色譜根據(jù)2005年版《中國(guó)藥典》一部附錄XD法提取樣品揮發(fā)油和測(cè)定出油率,提取的10批次樣品揮發(fā)油分別用無(wú)水硫酸鈉除去水分,然后置于100mL量瓶中,加乙醚定容至刻度,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。取各供試品溶液10μL,按上述色譜條件進(jìn)行GC-MS分析,得到GC-MS指紋色譜圖(圖1)。圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜檢索及人工解析研究其化學(xué)結(jié)構(gòu),比較10批樣品色譜圖后,從中選定20個(gè)共有峰指紋峰構(gòu)成廣西莪術(shù)指紋圖譜的穩(wěn)定特征峰,選擇14號(hào)峰β-欖香烯為內(nèi)參峰(S峰),以其保留時(shí)間和峰面積為1,分別計(jì)算各特征峰的調(diào)整保留時(shí)間之比(α值)和相對(duì)峰面積(峰面積之比),結(jié)果見(jiàn)表1。2.2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)pmi-1330將提取干燥的10批次莪術(shù)油30mg,溶于3mL無(wú)水乙醇中,莪術(shù)油的初始質(zhì)量濃度為10g·L-1。實(shí)驗(yàn)中用含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將莪術(shù)油稀釋為100.0mg·L-1的濃度給藥,陰性對(duì)照組為10mL·L-1的無(wú)水乙醇培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2細(xì)胞,接種于96孔板,細(xì)胞貼壁后加入藥物。于加藥后48h取出板,每孔加入20μLMTT溶液,4h后吸出上清液,加入150μLDMSO,震蕩10min,在酶標(biāo)儀上于490nm處測(cè)定對(duì)照組及加藥組的吸光度(A),結(jié)果見(jiàn)表2。2.3關(guān)聯(lián)度分析根據(jù)文獻(xiàn)方法計(jì)算廣西莪術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜特征與藥效作用之間的灰關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序。本研究將不同批次的廣西莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率設(shè)為參考序列(母序列),比較數(shù)列(子序列)為20個(gè)特征峰,1~20號(hào)特征峰分別用x1~x20表示。將母序列與子序列進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析,依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小,確定了各特征成分對(duì)抗腫瘤作用貢獻(xiàn)的大小順序?yàn)?莪術(shù)醇>莪術(shù)二酮>β-欖香烯>吉馬酮>莪術(shù)酮>α-丁子香烯>δ-瑟林烯>β-石竹烯>β-欖香烯酮>a-蒎烯>α-石竹烯>桉油素>樟腦>2-壬醇>異龍腦莪術(shù)烯>δ-欖香烯>莰烯>D-檸檬烯>龍腦。結(jié)果表明廣西莪術(shù)抗腫瘤作用是其內(nèi)“有效組分群”共同作用的結(jié)果,各特征峰代表的化學(xué)成分與其增殖抑制作用的關(guān)聯(lián)度雖大小不一,但都起了一定的作用。結(jié)果見(jiàn)表3。3指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法是國(guó)家中醫(yī)藥管理局認(rèn)可的用來(lái)判斷中藥化學(xué)成分相似性的一種方法。從理論上講,化學(xué)指紋圖譜相似度高的藥物,化學(xué)成分相似,其藥效也應(yīng)該相似。但研究發(fā)現(xiàn),10批次廣西莪術(shù)揮發(fā)油的指紋圖譜用相似度評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)后,在主要特征峰不一致時(shí),仍具有很高的相似度。如在橫縣主產(chǎn)區(qū)的2個(gè)批次的樣品中均未檢測(cè)到莪術(shù)醇,但GC-MS相似度均達(dá)到了0.99以上?？鼓[瘤藥效學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不含莪術(shù)醇的上述2個(gè)批次樣品對(duì)腫瘤增殖的抑制作用較低,抑制率僅為8.88%和8.49%。來(lái)自貴港的6個(gè)批次樣品莪術(shù)醇含量最高,而其對(duì)腫瘤增殖的抑制作用大,抑制率98.57%。由此可以看出,不能僅以指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的方法來(lái)推測(cè)藥效。灰關(guān)聯(lián)度分析作為對(duì)模糊系統(tǒng)研究的有效手段,已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)、投資決策、環(huán)境檢測(cè)、人員考核、項(xiàng)目評(píng)估以及機(jī)械加工等過(guò)程控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)中。大量的研究已證實(shí),上述各領(lǐng)域的研究共同特點(diǎn)是系統(tǒng)的信息量較少,而涉及的因素多,而且這些因素往往是相互影響、相互作者,并非獨(dú)立的。目前灰關(guān)聯(lián)度分析應(yīng)用于對(duì)中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少,但其具有既包含有已知信息,又包含有未知信息的特點(diǎn),通過(guò)對(duì)其研究可利用已知的信息,去揭示未知的信息,因此更適于含有復(fù)化學(xué)成分的中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。基于此,本研究通過(guò)尋找“有效組分群”的指紋特征與抗腫瘤活性效應(yīng)之間的聯(lián)系來(lái)開(kāi)展研究,在廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜和藥學(xué)效研究的基礎(chǔ)上,獲得了廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜20個(gè)特征峰面積與對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用的量化數(shù)據(jù),采用灰關(guān)聯(lián)度分析技術(shù),以相對(duì)關(guān)聯(lián)