草揮發(fā)油-環(huán)糊精包合物的制備與評(píng)價(jià)

草揮發(fā)油-環(huán)糊精包合物的制備與評(píng)價(jià)

野生稻是碳水化合物中最受歡迎的天然植物種類(lèi)之一。纈草中含有揮發(fā)油(單萜類(lèi)與倍半萜類(lèi))、木脂素類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚羥酸類(lèi)等成分,對(duì)鎮(zhèn)靜催眠活性成分的研究主要集中在揮發(fā)油類(lèi)以及纈草三酯類(lèi)。其中,纈草揮發(fā)油能明顯抑制小鼠的外觀行為活動(dòng),顯著加強(qiáng)戊巴比妥鈉及水合氯醛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用,對(duì)戊四氮、電刺激所致的小鼠驚厥也有明顯的抑制作用。但是,纈草揮發(fā)油中的纈草烯酸(valerenicacids)對(duì)高濕和高溫條件下的穩(wěn)定性差,且具有不良?xì)馕?影響了藥效的發(fā)揮和患者用藥的順應(yīng)性。陳洪燕等采用飽和水溶液法,制備了纈草揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物,但未見(jiàn)產(chǎn)物的表征與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。本文以提高纈草揮發(fā)油的穩(wěn)定性和掩蓋不良?xì)馕稙槟康?進(jìn)行了纈草揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備與評(píng)價(jià),以便為纈草制劑的研究提供依據(jù)。1藥物、試劑和儀器JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Pyris-1差示量熱掃描儀(美國(guó)PE公司);X-射線粉末衍射儀(荷蘭帕納科公司);GC-14C氣相色譜儀(日本島津公司);N2000色譜工作站(浙大智達(dá));PHS-3TC數(shù)顯pH計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司);YG120藥物光照實(shí)驗(yàn)箱(上海恒誼制藥有限公司);H-PTH-150AKH恒溫恒濕試驗(yàn)箱(宏瑞達(dá)科技蘇州有限公司)。纈草揮發(fā)油(江口縣苗藥生物科技有限公司,批號(hào)VO080911);乙酸龍腦酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110759-200303);其他試劑均為分析純。2方法2.1對(duì)照品貯備液、內(nèi)標(biāo)溶液的制備本試驗(yàn)采用氣相色譜法,以纈草揮發(fā)油中含量較高的乙酸龍腦酯作為指標(biāo),對(duì)纈草提取物進(jìn)行了制劑研究。氣相色譜條件:氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);載氣氮?dú)?流速1.0mL·min-1(50kp);空氣流量55kp,氫氣流量50kp;程序升溫從70℃(2min)以10℃·min-1升至90℃(2min),再以8℃·min-1升至125℃(10min);分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口-檢測(cè)器溫度180℃;進(jìn)樣量2μL。乙酸龍腦酯對(duì)照品貯備液的制備:精密稱(chēng)取乙酸龍腦酯10.93mg至量瓶中,加無(wú)水乙醇定容,配制成2.186g·L-1的溶液。內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的制備:精密稱(chēng)取水楊酸甲酯10.71mg至量瓶中,加無(wú)水乙醇定容,配制成2.142g·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。精密吸取乙酸龍腦酯貯備液0.125,0.25,0.5,1.0,2.0mL置5mL量瓶中,分別加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5mL,以無(wú)水乙醇定容,得系列濃度溶液,進(jìn)樣測(cè)定(n=3),以乙酸龍腦酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對(duì)乙酸龍腦酯的質(zhì)量濃度(X)線性回歸,得回歸方程Y=0.0038X+0.0143,r=0.9999,乙酸龍腦酯在54.65~874.4mg·L-1線性關(guān)系良好。2.23草提取物環(huán)糊精包劑的制備2.2.1cd-vo包合物的制備飽和水溶液-攪拌法:稱(chēng)取β-環(huán)糊精(β-CD)3g各3份,按37g·L-1加水80mL,40℃加熱使溶解,以3∶1緩慢滴加50%纈草揮發(fā)油乙醇溶液2mL,得環(huán)糊精纈草揮發(fā)油醇溶液(CD-VO)。恒溫條件下對(duì)CD-VO磁力攪拌(300r·min-1)1h,冷卻至室溫,冷藏(4℃,24h)后,減壓濾過(guò),沉淀以少量水洗滌,并以纈草揮發(fā)油二倍量的石油醚分2次洗滌,40℃干燥箱內(nèi)4h至恒重,研碎,得包合物白色粉末。飽和水溶液-超聲法:將上述CD-VO溶液置于普通超聲儀超聲1h,冷藏后,同上處理,得包合物白色粉末。飽和水溶液-超聲細(xì)胞粉碎法:將上述CD-VO溶液用超聲波細(xì)胞粉碎儀處理100次(500W,工作2s,間隙3s),冷藏后,同上處理,得包合物白色粉末。研磨法:稱(chēng)取β-環(huán)糊精3份,分別加入2倍量蒸餾水,研勻,以3∶1緩慢滴加50%纈草揮發(fā)油乙醇溶液2mL,研磨1h,減壓濾過(guò)后,同上處理,得包合物白色粉末。2.2.2超聲條件影響-cd與草揮發(fā)油包合物得率和草揮發(fā)油包合率的條件根據(jù)單因素考察結(jié)果,采用飽和水溶液-超聲細(xì)胞粉碎法制備纈草揮發(fā)油包合物,考察β-CD與纈草揮發(fā)油的比例(A,g·mL-1)、乙醇與纈草揮發(fā)油體積比(B)、超聲次數(shù)(C)和超聲頻率(D,MHz)對(duì)包合物得率和纈草揮發(fā)油包合率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用均勻設(shè)計(jì)表,因素水平表見(jiàn)表1。2.3包組分的檢查2.3.1與溫度關(guān)系的“溫度”關(guān)系差示掃描量熱法是在程序控制溫度下,測(cè)量輸給物質(zhì)和參比物的功率差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)。對(duì)纈草揮發(fā)油、β-CD、物理混合物、包合物進(jìn)行DSC掃描,以空坩堝為參比,另一坩堝放入樣品,升溫速度10℃·min-1,掃描范圍50~300℃,測(cè)定氣體為氮?dú)狻?.3.2晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定X-射線通過(guò)晶體時(shí)將發(fā)生衍射,衍射波疊加的結(jié)果使射線的強(qiáng)度在某些方向上加強(qiáng),在其他方向上減弱。分析在照相底片上得到的衍射花樣,便可確定晶體結(jié)構(gòu)。測(cè)試條件Cu-ka靶,X-射線波長(zhǎng)1.5406,高壓40kV,管流30mA。取β-CD、物理混合物和包合物適量,在5~502θ掃描,掃描速度2°·min-1。2.4包組分的穩(wěn)定性試驗(yàn)2.4.1乙酸龍腦酯含量的測(cè)定將包合物置于已在干燥器中平衡24h的稱(chēng)量瓶中,鋪成0.3~0.5cm的厚度,分別敞口置于(RH92.5%,25℃)密閉干燥器中,于第0,5,10天取樣,考察樣品外觀形狀,按照含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定方法測(cè)量物料中乙酸龍腦酯的含量。2.4.2適應(yīng)高、低表面活性劑的外觀形狀,根據(jù)測(cè)定材將包合物置于稱(chēng)量瓶中,鋪成0.3~0.5cm的厚度,敞口放置于恒溫恒濕試驗(yàn)箱(60℃,45%RH)中,于第0,5,10天取樣,考察樣品外觀形狀,按照含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定方法測(cè)量物料中乙酸龍腦酯的含量。2.4.3乙酸龍腦酯含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)將包合物置于稱(chēng)量瓶中,鋪成0.3~0.5cm的厚度,敞口放置于光照實(shí)驗(yàn)箱[(4500±500)lx,25℃]中,于第0,5,10天取樣,考察樣品外觀形狀,按照含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定方法測(cè)量物料中乙酸龍腦酯的含量。3試驗(yàn)結(jié)果3.1得率和揮發(fā)油包合率的確定纈草揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物制備方法對(duì)得率和揮發(fā)油包合率的影響見(jiàn)表2,飽和水溶液-超聲細(xì)胞粉碎法制備的包合物得率和揮發(fā)油包合率均較高,故選擇該法進(jìn)行包合物。3.2響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果均勻設(shè)計(jì)法制備纈草揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。將表3中各因素的各水平分別以包合物得率和包合率為指標(biāo),采用《均勻設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)優(yōu)化軟件》進(jìn)行多元回歸分析。得率為指標(biāo)的回歸方程Y=13.7-3.86A+6.99B+0.0377C+0.0853D;剩余標(biāo)準(zhǔn)差(S)=12.2,r=0.8642。按后退法分別剔除對(duì)回歸方程貢獻(xiàn)最小的方程項(xiàng),得到回歸方程Y=29.0-3.48A+0.0901D;S=11.2,r=0.8562。經(jīng)上述優(yōu)化軟件自檢,α=0.05,通過(guò)F檢驗(yàn),各因素優(yōu)化值Y的最大值88.8%,A為2.78,D為760.45。包合率為指標(biāo)的回歸方程Y=60.1-2.99A-0.542B+0.0377C+0.0269D;S=4.2,r=0.9022。按后退法分別剔除對(duì)回歸方程貢獻(xiàn)最小的方程項(xiàng),得到回歸方程Y=39.6-3.68A+0.0549D;S=1.2,r=0.9562。經(jīng)上述優(yōu)化軟件自檢,α=0.05,通過(guò)F檢驗(yàn),各因素優(yōu)化值Y的最大值92.5%,A為2.92,D為770.67。從以上2個(gè)方程可見(jiàn),影響包合物得率和包合率的主要因素為A,D,即β-CD與纈草揮發(fā)油的比例和超聲強(qiáng)度。根據(jù)優(yōu)化的自變量值并結(jié)合生產(chǎn)的實(shí)際情況和需要,設(shè)計(jì)了1個(gè)新的試驗(yàn)條件:A=3∶1,B=1∶1,C=220次,D=780Hz,按此條件實(shí)施3次,結(jié)果包合物中乙酸龍腦酯的含量為10.14%,包合物得率為84.78%,包合率為86.23%,RSD1.7%。結(jié)果表明最終優(yōu)化試驗(yàn)條件制得的包合物較為理想,且重復(fù)性良好。3.3包組分的檢查3.3.1物理混合物的熱流曲線β-CD在60℃附近有1個(gè)顯著的脫水吸熱峰,220℃附近有一特征相變,固體β-CD開(kāi)始相變吸熱;物理混合物的熱流曲線呈現(xiàn)β-CD與纈草揮發(fā)油兩者熱吸收相疊加的特征,在60℃附近,物理混合物有1個(gè)較為明顯的吸熱峰,分析可能為β-CD的特征吸收,見(jiàn)圖1。包合物在整個(gè)測(cè)試溫度范圍呈現(xiàn)全新的熱力學(xué)特征,但其紫外區(qū)的全波長(zhǎng)掃描基本沒(méi)有變化,排除了形成新化合物的可能,說(shuō)明形成的是物理包合物。3.3.2包合物的圖譜物理混合物的衍射峰呈現(xiàn)纈草揮發(fā)油和β-CD疊加的特征;包合物的圖譜不再是兩者的簡(jiǎn)單疊加,其在82θ時(shí)的峰消失,在182θ左右出現(xiàn)新的衍射峰,在322θ左右的峰消弱或消失,表明纈草揮發(fā)油與β-CD形成了包合物,見(jiàn)圖2。3.4高溫和光照環(huán)境穩(wěn)定性試驗(yàn)以GC測(cè)定纈草揮發(fā)油和包合物中乙酸龍腦酯的含量,見(jiàn)表4。纈草揮發(fā)油在高溫和光照環(huán)境中不穩(wěn)定,易揮發(fā);纈草揮發(fā)油-β-CD包合