藥用植物冬蟲夏草、異龍腦和配伍的研究

藥用植物冬蟲夏草、異龍腦和配伍的研究

婆羅洲是傳統(tǒng)的中醫(yī)之一，已經(jīng)使用了1500多年?！稘h語手冊(cè)》（2005年版）中記載了63種含有婆羅洲元葉的中藥組合。目前《中國藥典》收載有兩種冰片,一為冰片(為區(qū)別計(jì),下稱“合成龍腦”),主成分為龍腦(消旋龍腦)和異龍腦的混合物,規(guī)定其中消旋龍腦的含量不低于55.0%;二為新收錄的天然冰片(右旋龍腦),主成分為結(jié)構(gòu)確定的右旋龍腦,純度不低于95.0%。雖然中醫(yī)傳統(tǒng)使用梅片等天然冰片,但由于天然冰片的來源以前依靠進(jìn)口,所以建國后中藥復(fù)方中使用的冰片主要為合成龍腦。近年來有研究表明合成龍腦的質(zhì)量不穩(wěn)定,主要成分可隨貯藏時(shí)間延長而發(fā)生變化。魏剛等對(duì)部分市售合成龍腦的質(zhì)量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)某些藥店出售的合成龍腦中樟腦(有毒性)含量可達(dá)45%以上,有的甚至達(dá)97%,而且隨著時(shí)間延長,合成龍腦中龍腦和異龍腦含量逐漸降低,樟腦含量升高,表明龍腦和異龍腦在儲(chǔ)存狀態(tài)下有轉(zhuǎn)化成樟腦的趨勢(shì),而且時(shí)間越長,轉(zhuǎn)化成樟腦的比率越高。因此,在進(jìn)行合成龍腦在動(dòng)物體內(nèi)的成分測(cè)定時(shí),經(jīng)常有樟腦成分被檢出,這應(yīng)與合成龍腦原料中含有一定量的樟腦有關(guān)。雖然樟腦作為中藥應(yīng)用在我國也有上千年的歷史,但中醫(yī)很早就認(rèn)識(shí)到樟腦有毒和冰片無毒的差異。因此改變含冰片復(fù)方的這種尷尬局面的途徑之一是采用天然冰片代替合成龍腦入藥,而我國新開辟的天然冰片資源為改變這種局面提供了可能?！吨袊幍洹纷?005年版起開始收錄天然冰片,該藥材是用我國江西、湖南等地發(fā)現(xiàn)的樟科植物樟(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)的新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶。張伯禮等對(duì)天然冰片的安全性和藥理作用做了對(duì)比研究,認(rèn)為天然冰片無誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成率增加的作用,對(duì)骨髓也無抑制作用,其安全性可以得到保證,在一定程度上可以代替合成龍腦入藥。然而,本課題組在用GC-MS法進(jìn)行小鼠體內(nèi)冰片藥動(dòng)學(xué)研究時(shí),無論是給小鼠灌服天然冰片還是合成冰片,在其血液、肝臟等組織樣品中均檢測(cè)到了樟腦的色譜峰。在冰片原料藥中沒有檢測(cè)到樟腦存在的情況下,在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到了樟腦成分其來源值得思考。為了探索冰片是否可在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化(或代謝)為樟腦,本研究進(jìn)行了天然冰片、合成龍腦和異龍腦在動(dòng)物(小鼠、大鼠和家兔)體內(nèi)的GC-MS定性分析。一、材料表面1.藥品、化學(xué)品天然冰片(純度>98.0%,江西省吉林市林科天然冰片廠,批號(hào):2060800);合成龍腦和異龍腦(純度均>98.0%,廣州市黃埔化工廠提供);冰片對(duì)照品(分析純,中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):110743-200504);萘(分析純,中國藥品生物制品檢驗(yàn)所,111673-200401)。正己烷(HPLC級(jí),SKChemicals,韓國);乙醇(特級(jí)純,江蘇漢邦科技有限公司);CMC-Na(分析純,天津市北方化玻購銷中心);NaCl(分析純,天津市北方化玻購銷中心);PEG-400(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);粟米油(食用級(jí));石蠟油(分析純,天津市沽工商實(shí)業(yè)公司);0.9%生理鹽水。2.ankimdl-40b勻漿器(ULTRA-TURRAXT8,德國);臺(tái)式離心機(jī)(AnkeTDL-40B,上海安亨科學(xué)儀器廠);振蕩器(HY-4調(diào)速多用振蕩器,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);超聲儀(SB25-12DTD,寧波新芝生物科技股份有限公司)3.動(dòng)物及家兔不同性別的動(dòng)物潔凈級(jí)昆明種小鼠,體重20±2g,雌雄各半;潔凈級(jí)SD大鼠,雄性,體重約200g;新西蘭家兔,雄性,體重約1kg。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥前24h禁食不禁水。4.離子源溫度FinniganDSQTrace氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(美國熱電公司);Xcalibular數(shù)據(jù)工作站。色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(0.25mm×30m,膜厚0.25μm,美國安捷倫公司);溫度采用程序升溫方式,柱初溫80℃,保持1min,然后以30℃/min升溫至145℃,保持1min;載氣為高純氦氣(99.999%),流速1mL/min;進(jìn)樣量為0.5μL,分流比為10:1;進(jìn)樣口溫度為200℃;EI離子源,電子能量為70eV,離子源溫度250℃;檢測(cè)方式有兩種,全掃描方式(m/z掃描范圍50～650)和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM方式,樟腦、龍腦與異龍腦均為m/z95,萘為m/z128)。5.溶液制備(1)天然婆羅洲銀幣和合成龍腦溶液的制備稱取天然冰片約50mg,用正己烷稀釋至50mL,得到1mg/mL的天然冰片溶液;同法配制1mg/mL的合成龍腦溶液。(2)天然婆羅洲的四種混合溶液的制備分別稱取約0.25g天然冰片,用0.8%CMC-Na,粟米油,石蠟油,PEG400各2.5mL混懸,得到天然冰片的四種混懸液。(3)內(nèi)標(biāo)萘的制備稱取萘0.1022g,用正己烷溶解并稀釋至50mL;精密吸取5mL,用正己烷稀釋至50mL,得到0.24mg/mL的內(nèi)標(biāo)萘溶液。(4)異龍腦和懸浮液的合成稱取合成龍腦、異龍腦各約0.3g,分別用3m10.8%CMC-Na混懸均勻即可。二、方法1.全血樣的檢測(cè)取肝臟樣品約0.1g于10mL試管中,加入0.5mL生理鹽水,勻漿,用0.5mL生理鹽水沖洗勻漿頭,洗液并入試管中;然后將組織勻漿超聲5min;再加入100μL的0.24mg/mL內(nèi)標(biāo)萘溶液,混勻;加入1.5mL正己烷萃取,并于振蕩器上中速振蕩20min,以3500rpm離心5min;然后取上清液0.5μL,注入GC-MS儀進(jìn)行全掃描分析或SIM分析。其它組織樣品稱重,按照同法處理。血漿樣品定量吸取200μL,加入100μL的0.24mg/mL內(nèi)標(biāo)萘溶液,混勻,加入1.5mL正己烷,萃取離心過程同肝臟一樣。以空白肝臟和血漿樣品做對(duì)照。2.gc-ms分析將配制好的天然冰片和合成龍腦溶液直接注入氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。用0.8%CMC-Na溶液混懸0.25g天然冰片,按照1.0g/kg的給藥量給小鼠灌胃,并對(duì)以下制備的所有樣品按“樣品處理方法”繼續(xù)處理后進(jìn)行GC-MS分析:(1)空白血漿提取液。(2)全血加入天然冰片后離心,取血漿進(jìn)行提取。(3)給小鼠灌胃天然冰片30min后的血漿進(jìn)行提取。(4)空白肝臟樣品。(5)空白肝臟取出后立即加入天然冰片溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的樣品。(6)空白肝臟勻漿后加入天然冰片,在37℃環(huán)境中放置30min后的樣品。(7)取生理鹽水,加入天然冰片后勻漿處理的樣品。(8)天然冰片給小鼠灌胃30min后的肝臟樣品。3.gc-ms分析取小鼠,稱重,灌服1.0g/kg的配制好的天然冰片0.8%CMC-Na混懸液。30min后從小鼠眼球取血,抗凝離心取血漿;然后處死,取肝臟和心、脾、肺、腎、腦等組織樣品,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。若需放置,則在-30℃冰箱保存。4.不同溶劑對(duì)小鼠血漿和肝臟組織gc-ms分析的影響,主要通過添加天然盤由于在不同文獻(xiàn)中采用不同的溶劑溶解冰片,為了考察不同溶劑對(duì)冰片轉(zhuǎn)化為樟腦的影響,以排除可能造成的干擾,我們將配制的幾種不同溶劑(0.8%CMC-Na,粟米油、石蠟油和PEG400)的天然冰片混懸液分別給小鼠灌服,30min后取小鼠的血漿和肝臟樣品,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。5.混懸液、異龍腦混懸液、異龍腦混懸液另取小鼠,分別灌服配制好的合成龍腦、異龍腦混懸液。30min后處死,取血漿和肝臟等組織樣品,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。6.gc-ms分析取小鼠12只,稱重后隨機(jī)分為二組,每組6只,分別灌服1.0g/kg的天然冰片CMC-Na混懸液。每組分別在5min,15min,30min,45min,60min,90min時(shí)處死,取血漿和肝臟樣品,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。取大鼠1只,稱重,按照1.0g/kg體重灌服配制的天然冰片CMC-Na混懸液。在5min,15min,30min,60min眼眶靜脈叢取血,每次約lmL,抗凝離心取血漿,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。取新西蘭家兔1只,稱重,按照1.1g/kg體重灌服配制的天然冰片CMC-Na混懸液。在5min,10min,15min,45min,60min,90min,120min時(shí)耳緣動(dòng)脈插管取血,抗凝離心取血漿,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析。三、結(jié)果1.分離和純化了所有的組織在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下,GC-MS可以很好地分離樟腦、異龍腦、龍腦和內(nèi)標(biāo)萘的色譜峰,樟腦和萘都與其他主要成分達(dá)到基線分離,而且空白基質(zhì)(血漿和肝臟等組織)對(duì)于各成分的分析無干擾。由于其他組織的分析結(jié)果與肝臟結(jié)果類似,以下結(jié)果主要以肝臟為例進(jìn)行說明。圖1表示GC-MS對(duì)空白肝臟和空白肝臟加冰片后各成分的全掃描分析結(jié)果。2.不同基質(zhì)對(duì)樟腦分離的影響天然冰片、合成龍腦等冰片原料藥的色譜圖表明,給動(dòng)物灌服所用的天然冰片和合成龍腦原料藥中幾乎檢測(cè)不到樟腦。結(jié)果如圖2所示。通過對(duì)冰片原料藥與“原料藥測(cè)定色譜圖及天然冰片在小鼠血漿和肝臟處理過程中的轉(zhuǎn)化研究”中(1)～(8)空白、對(duì)照等不同樣品的對(duì)比分析,結(jié)果表明天然冰片在與各種基質(zhì)混合后,沒有檢測(cè)到樟腦,其圖譜與不加任何基質(zhì)的分析結(jié)果基本一致,這表明在含天然冰片的血液和肝臟樣品處理過程中沒有產(chǎn)生樟腦;小鼠灌服冰片30min后血漿和肝臟中均檢測(cè)到樟腦峰;而在(2)、(5)、(6)、(7)的處理結(jié)果中也未檢測(cè)到樟腦峰,以上對(duì)比試驗(yàn)基本排除了天然冰片在樣品后期處理過程中轉(zhuǎn)化為樟腦的可能性。部分結(jié)果見圖3。3.單獨(dú)灌服天然冰酒的穩(wěn)定性在給小鼠灌服冰片30min后的血漿和組織樣品中,單獨(dú)灌服天然冰片、合成龍腦或異龍腦的樣品中均在同一保留時(shí)間檢測(cè)到一色譜峰,該峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片離子圖與樟腦相應(yīng)數(shù)據(jù)一致(見圖3)。4.小鼠體內(nèi)gc-ms分析取灌服天然冰片后小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和血漿等組織,按“樣品處理方法”處理后進(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果各組織樣品中都檢測(cè)到樟腦峰的存在。圖4為小鼠灌服天然冰片30min后腦組織中的GC-MS圖(SIM掃描方式)。由以上色譜圖結(jié)果可以看出,小鼠腦組織中能夠檢測(cè)到較明顯的樟腦峰。在小鼠的其它各組織的GC-MS分析色譜圖中也明顯檢測(cè)到樟腦蜂的存在。5.灌服天然冰液對(duì)小鼠肝臟中g(shù)c-ms分析在用不同溶劑(CMC-Na,粟米油、石蠟油和PEG400)配制天然冰片混懸液給小鼠灌服后,在小鼠的肝臟樣品中也均檢測(cè)到樟腦峰。圖5為灌服天然冰片不同混懸液后小鼠肝臟中的GC-MS圖譜(全掃描方式)。結(jié)果表明,用不同溶劑制備天然冰片混懸液灌服小鼠后的樣品中均檢測(cè)到樟腦峰的存在;不同溶劑對(duì)天然冰片在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成樟腦的情況沒有實(shí)質(zhì)區(qū)別。6.不同時(shí)間點(diǎn)的血漿中樟腦的相對(duì)含量(1)通過計(jì)算二批小鼠灌服天然冰片后不同時(shí)間點(diǎn)所取血漿和肝臟中樟腦與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值,對(duì)樟腦相對(duì)含量的變化趨勢(shì)作圖分析(見圖6)。結(jié)果表明,在小鼠血漿和肝臟中樟腦的含量都隨時(shí)間延長而成一定規(guī)律變化。(2)給大鼠灌服天然冰片后,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿中樟腦相對(duì)含量變化趨勢(shì)作圖(見圖7),表明樟腦的相對(duì)含量隨著時(shí)間的變化而呈一定的變動(dòng)。(3)給新西蘭家兔灌服天然冰片后,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿中樟腦相對(duì)含量變化趨勢(shì)做圖(見圖8)。結(jié)果表明,隨著時(shí)間的變化,家兔血漿中樟腦含量逐漸增加,在所取的試驗(yàn)(時(shí)間)點(diǎn)內(nèi)沒有測(cè)得最高值。四、不同溶劑和混懸液對(duì)“人工”的解釋1.冰片在中藥復(fù)方中的應(yīng)用非常普遍(如復(fù)方丹參滴丸等),一方面它本身具有開竅醒神和消炎止痛的作用,另一方面它還可以佐使其他藥物透過血腦屏障而發(fā)揮作用,即“佐使則有功”的特點(diǎn),王寧生等在此方面作了大量工作,其研究結(jié)果對(duì)于揭示冰片的作用特點(diǎn)和擴(kuò)大使用范圍很有幫助。隨著《中國藥典》(2005年版)收載了我國出產(chǎn)的天然冰片,這使得以前天然冰片來源稀缺的問題得到了解決,因此冰片(合成龍腦)有被天然冰片逐漸取代入藥的趨勢(shì)。近年來關(guān)于天然冰片研究的報(bào)道相對(duì)較少,僅有張伯禮等對(duì)其進(jìn)行安全性和藥效學(xué)方面的對(duì)比研究,認(rèn)為與合成龍腦相比,天然冰片的安全性可以得到保證;但關(guān)于天然冰片的在生物體內(nèi)的分析和藥動(dòng)學(xué)研究鮮見報(bào)道。本研究進(jìn)行了天然冰片在動(dòng)物體內(nèi)的GC-MS分析,結(jié)果表明,天然冰片在動(dòng)物(小鼠、大鼠和家兔)體內(nèi)有轉(zhuǎn)化(或代謝)為樟腦的可能。經(jīng)對(duì)天然冰片原料藥、空白對(duì)照,以及變換各種組合條件后的GC-MS分析,可以證實(shí)給小鼠灌服天然冰片后在體內(nèi)可檢測(cè)到樟腦,這提示冰片在體內(nèi)有可能通過某種代謝機(jī)制轉(zhuǎn)化為樟腦。由于樟腦具有一定毒性,特別對(duì)嬰幼兒毒性更大,因此本研究結(jié)果在一定程度上可用來解釋《中國藥典》中對(duì)“冰片(合成龍腦)”中“注意:孕婦慎用”的禁忌內(nèi)容,以及加拿大衛(wèi)生部慎用“秘制保嬰丹”通知的部分原因,本研究可以總結(jié)出如下結(jié)論:不是因冰片的結(jié)構(gòu)與樟腦相似具有毒性,而是冰片可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為樟腦,因而具有一定毒性。因此,本研究結(jié)果可對(duì)進(jìn)一步考察天然冰片的安全性具有一定的參考價(jià)值。為此,本研究建議在《中國藥典》的“天然冰片(右旋龍腦)”項(xiàng)目中增加與“冰片(合成龍腦)”同樣的注意事項(xiàng)(即“注意:孕婦慎用”),以保證用藥的安全。2.本研究對(duì)不同溶劑制成的天然冰片混懸液給小鼠灌服后的體內(nèi)成分進(jìn)行了GC-MS分析,結(jié)果表明,無論采用CMC-Na,還是