藥用植物冬蟲夏草、異龍腦和配伍的研究

藥用植物冬蟲夏草、異龍腦和配伍的研究

婆羅洲是傳統(tǒng)的中醫(yī)之一，已經(jīng)使用了1500多年?！稘h語手冊》（2005年版）中記載了63種含有婆羅洲元葉的中藥組合。目前《中國藥典》收載有兩種冰片,一為冰片(為區(qū)別計,下稱“合成龍腦”),主成分為龍腦(消旋龍腦)和異龍腦的混合物,規(guī)定其中消旋龍腦的含量不低于55.0%;二為新收錄的天然冰片(右旋龍腦),主成分為結(jié)構(gòu)確定的右旋龍腦,純度不低于95.0%。雖然中醫(yī)傳統(tǒng)使用梅片等天然冰片,但由于天然冰片的來源以前依靠進口,所以建國后中藥復方中使用的冰片主要為合成龍腦。近年來有研究表明合成龍腦的質(zhì)量不穩(wěn)定,主要成分可隨貯藏時間延長而發(fā)生變化。魏剛等對部分市售合成龍腦的質(zhì)量進行了分析,發(fā)現(xiàn)某些藥店出售的合成龍腦中樟腦(有毒性)含量可達45%以上,有的甚至達97%,而且隨著時間延長,合成龍腦中龍腦和異龍腦含量逐漸降低,樟腦含量升高,表明龍腦和異龍腦在儲存狀態(tài)下有轉(zhuǎn)化成樟腦的趨勢,而且時間越長,轉(zhuǎn)化成樟腦的比率越高。因此,在進行合成龍腦在動物體內(nèi)的成分測定時,經(jīng)常有樟腦成分被檢出,這應與合成龍腦原料中含有一定量的樟腦有關。雖然樟腦作為中藥應用在我國也有上千年的歷史,但中醫(yī)很早就認識到樟腦有毒和冰片無毒的差異。因此改變含冰片復方的這種尷尬局面的途徑之一是采用天然冰片代替合成龍腦入藥,而我國新開辟的天然冰片資源為改變這種局面提供了可能。《中國藥典》自2005年版起開始收錄天然冰片,該藥材是用我國江西、湖南等地發(fā)現(xiàn)的樟科植物樟(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)的新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶。張伯禮等對天然冰片的安全性和藥理作用做了對比研究,認為天然冰片無誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成率增加的作用,對骨髓也無抑制作用,其安全性可以得到保證,在一定程度上可以代替合成龍腦入藥。然而,本課題組在用GC-MS法進行小鼠體內(nèi)冰片藥動學研究時,無論是給小鼠灌服天然冰片還是合成冰片,在其血液、肝臟等組織樣品中均檢測到了樟腦的色譜峰。在冰片原料藥中沒有檢測到樟腦存在的情況下,在小鼠體內(nèi)檢測到了樟腦成分其來源值得思考。為了探索冰片是否可在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化(或代謝)為樟腦,本研究進行了天然冰片、合成龍腦和異龍腦在動物(小鼠、大鼠和家兔)體內(nèi)的GC-MS定性分析。一、材料表面1.藥品、化學品天然冰片(純度>98.0%,江西省吉林市林科天然冰片廠,批號:2060800);合成龍腦和異龍腦(純度均>98.0%,廣州市黃埔化工廠提供);冰片對照品(分析純,中國藥品生物制品檢定所,批號:110743-200504);萘(分析純,中國藥品生物制品檢驗所,111673-200401)。正己烷(HPLC級,SKChemicals,韓國);乙醇(特級純,江蘇漢邦科技有限公司);CMC-Na(分析純,天津市北方化玻購銷中心);NaCl(分析純,天津市北方化玻購銷中心);PEG-400(分析純,廣州化學試劑廠);粟米油(食用級);石蠟油(分析純,天津市沽工商實業(yè)公司);0.9%生理鹽水。2.ankimdl-40b勻漿器(ULTRA-TURRAXT8,德國);臺式離心機(AnkeTDL-40B,上海安亨科學儀器廠);振蕩器(HY-4調(diào)速多用振蕩器,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);超聲儀(SB25-12DTD,寧波新芝生物科技股份有限公司)3.動物及家兔不同性別的動物潔凈級昆明種小鼠,體重20±2g,雌雄各半;潔凈級SD大鼠,雄性,體重約200g;新西蘭家兔,雄性,體重約1kg。以上實驗動物均由中山大學實驗動物中心提供。各種實驗動物給藥前24h禁食不禁水。4.離子源溫度FinniganDSQTrace氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(美國熱電公司);Xcalibular數(shù)據(jù)工作站。色譜柱為DB-5MS毛細管色譜柱(0.25mm×30m,膜厚0.25μm,美國安捷倫公司);溫度采用程序升溫方式,柱初溫80℃,保持1min,然后以30℃/min升溫至145℃,保持1min;載氣為高純氦氣(99.999%),流速1mL/min;進樣量為0.5μL,分流比為10:1;進樣口溫度為200℃;EI離子源,電子能量為70eV,離子源溫度250℃;檢測方式有兩種,全掃描方式(m/z掃描范圍50～650)和選擇離子監(jiān)測(SIM方式,樟腦、龍腦與異龍腦均為m/z95,萘為m/z128)。5.溶液制備(1)天然婆羅洲銀幣和合成龍腦溶液的制備稱取天然冰片約50mg,用正己烷稀釋至50mL,得到1mg/mL的天然冰片溶液;同法配制1mg/mL的合成龍腦溶液。(2)天然婆羅洲的四種混合溶液的制備分別稱取約0.25g天然冰片,用0.8%CMC-Na,粟米油,石蠟油,PEG400各2.5mL混懸,得到天然冰片的四種混懸液。(3)內(nèi)標萘的制備稱取萘0.1022g,用正己烷溶解并稀釋至50mL;精密吸取5mL,用正己烷稀釋至50mL,得到0.24mg/mL的內(nèi)標萘溶液。(4)異龍腦和懸浮液的合成稱取合成龍腦、異龍腦各約0.3g,分別用3m10.8%CMC-Na混懸均勻即可。二、方法1.全血樣的檢測取肝臟樣品約0.1g于10mL試管中,加入0.5mL生理鹽水,勻漿,用0.5mL生理鹽水沖洗勻漿頭,洗液并入試管中;然后將組織勻漿超聲5min;再加入100μL的0.24mg/mL內(nèi)標萘溶液,混勻;加入1.5mL正己烷萃取,并于振蕩器上中速振蕩20min,以3500rpm離心5min;然后取上清液0.5μL,注入GC-MS儀進行全掃描分析或SIM分析。其它組織樣品稱重,按照同法處理。血漿樣品定量吸取200μL,加入100μL的0.24mg/mL內(nèi)標萘溶液,混勻,加入1.5mL正己烷,萃取離心過程同肝臟一樣。以空白肝臟和血漿樣品做對照。2.gc-ms分析將配制好的天然冰片和合成龍腦溶液直接注入氣相色譜-質(zhì)譜儀進行分析。用0.8%CMC-Na溶液混懸0.25g天然冰片,按照1.0g/kg的給藥量給小鼠灌胃,并對以下制備的所有樣品按“樣品處理方法”繼續(xù)處理后進行GC-MS分析:(1)空白血漿提取液。(2)全血加入天然冰片后離心,取血漿進行提取。(3)給小鼠灌胃天然冰片30min后的血漿進行提取。(4)空白肝臟樣品。(5)空白肝臟取出后立即加入天然冰片溶液和內(nèi)標溶液的樣品。(6)空白肝臟勻漿后加入天然冰片,在37℃環(huán)境中放置30min后的樣品。(7)取生理鹽水,加入天然冰片后勻漿處理的樣品。(8)天然冰片給小鼠灌胃30min后的肝臟樣品。3.gc-ms分析取小鼠,稱重,灌服1.0g/kg的配制好的天然冰片0.8%CMC-Na混懸液。30min后從小鼠眼球取血,抗凝離心取血漿;然后處死,取肝臟和心、脾、肺、腎、腦等組織樣品,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。若需放置,則在-30℃冰箱保存。4.不同溶劑對小鼠血漿和肝臟組織gc-ms分析的影響,主要通過添加天然盤由于在不同文獻中采用不同的溶劑溶解冰片,為了考察不同溶劑對冰片轉(zhuǎn)化為樟腦的影響,以排除可能造成的干擾,我們將配制的幾種不同溶劑(0.8%CMC-Na,粟米油、石蠟油和PEG400)的天然冰片混懸液分別給小鼠灌服,30min后取小鼠的血漿和肝臟樣品,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。5.混懸液、異龍腦混懸液、異龍腦混懸液另取小鼠,分別灌服配制好的合成龍腦、異龍腦混懸液。30min后處死,取血漿和肝臟等組織樣品,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。6.gc-ms分析取小鼠12只,稱重后隨機分為二組,每組6只,分別灌服1.0g/kg的天然冰片CMC-Na混懸液。每組分別在5min,15min,30min,45min,60min,90min時處死,取血漿和肝臟樣品,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。取大鼠1只,稱重,按照1.0g/kg體重灌服配制的天然冰片CMC-Na混懸液。在5min,15min,30min,60min眼眶靜脈叢取血,每次約lmL,抗凝離心取血漿,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。取新西蘭家兔1只,稱重,按照1.1g/kg體重灌服配制的天然冰片CMC-Na混懸液。在5min,10min,15min,45min,60min,90min,120min時耳緣動脈插管取血,抗凝離心取血漿,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析。三、結(jié)果1.分離和純化了所有的組織在本實驗設定條件下,GC-MS可以很好地分離樟腦、異龍腦、龍腦和內(nèi)標萘的色譜峰,樟腦和萘都與其他主要成分達到基線分離,而且空白基質(zhì)(血漿和肝臟等組織)對于各成分的分析無干擾。由于其他組織的分析結(jié)果與肝臟結(jié)果類似,以下結(jié)果主要以肝臟為例進行說明。圖1表示GC-MS對空白肝臟和空白肝臟加冰片后各成分的全掃描分析結(jié)果。2.不同基質(zhì)對樟腦分離的影響天然冰片、合成龍腦等冰片原料藥的色譜圖表明,給動物灌服所用的天然冰片和合成龍腦原料藥中幾乎檢測不到樟腦。結(jié)果如圖2所示。通過對冰片原料藥與“原料藥測定色譜圖及天然冰片在小鼠血漿和肝臟處理過程中的轉(zhuǎn)化研究”中(1)～(8)空白、對照等不同樣品的對比分析,結(jié)果表明天然冰片在與各種基質(zhì)混合后,沒有檢測到樟腦,其圖譜與不加任何基質(zhì)的分析結(jié)果基本一致,這表明在含天然冰片的血液和肝臟樣品處理過程中沒有產(chǎn)生樟腦;小鼠灌服冰片30min后血漿和肝臟中均檢測到樟腦峰;而在(2)、(5)、(6)、(7)的處理結(jié)果中也未檢測到樟腦峰,以上對比試驗基本排除了天然冰片在樣品后期處理過程中轉(zhuǎn)化為樟腦的可能性。部分結(jié)果見圖3。3.單獨灌服天然冰酒的穩(wěn)定性在給小鼠灌服冰片30min后的血漿和組織樣品中,單獨灌服天然冰片、合成龍腦或異龍腦的樣品中均在同一保留時間檢測到一色譜峰,該峰的保留時間和質(zhì)譜碎片離子圖與樟腦相應數(shù)據(jù)一致(見圖3)。4.小鼠體內(nèi)gc-ms分析取灌服天然冰片后小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和血漿等組織,按“樣品處理方法”處理后進行GC-MS分析,結(jié)果各組織樣品中都檢測到樟腦峰的存在。圖4為小鼠灌服天然冰片30min后腦組織中的GC-MS圖(SIM掃描方式)。由以上色譜圖結(jié)果可以看出,小鼠腦組織中能夠檢測到較明顯的樟腦峰。在小鼠的其它各組織的GC-MS分析色譜圖中也明顯檢測到樟腦蜂的存在。5.灌服天然冰液對小鼠肝臟中gc-ms分析在用不同溶劑(CMC-Na,粟米油、石蠟油和PEG400)配制天然冰片混懸液給小鼠灌服后,在小鼠的肝臟樣品中也均檢測到樟腦峰。圖5為灌服天然冰片不同混懸液后小鼠肝臟中的GC-MS圖譜(全掃描方式)。結(jié)果表明,用不同溶劑制備天然冰片混懸液灌服小鼠后的樣品中均檢測到樟腦峰的存在;不同溶劑對天然冰片在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成樟腦的情況沒有實質(zhì)區(qū)別。6.不同時間點的血漿中樟腦的相對含量(1)通過計算二批小鼠灌服天然冰片后不同時間點所取血漿和肝臟中樟腦與內(nèi)標的峰面積比值,對樟腦相對含量的變化趨勢作圖分析(見圖6)。結(jié)果表明,在小鼠血漿和肝臟中樟腦的含量都隨時間延長而成一定規(guī)律變化。(2)給大鼠灌服天然冰片后,對不同時間點的血漿中樟腦相對含量變化趨勢作圖(見圖7),表明樟腦的相對含量隨著時間的變化而呈一定的變動。(3)給新西蘭家兔灌服天然冰片后,對不同時間點的血漿中樟腦相對含量變化趨勢做圖(見圖8)。結(jié)果表明,隨著時間的變化,家兔血漿中樟腦含量逐漸增加,在所取的試驗(時間)點內(nèi)沒有測得最高值。四、不同溶劑和混懸液對“人工”的解釋1.冰片在中藥復方中的應用非常普遍(如復方丹參滴丸等),一方面它本身具有開竅醒神和消炎止痛的作用,另一方面它還可以佐使其他藥物透過血腦屏障而發(fā)揮作用,即“佐使則有功”的特點,王寧生等在此方面作了大量工作,其研究結(jié)果對于揭示冰片的作用特點和擴大使用范圍很有幫助。隨著《中國藥典》(2005年版)收載了我國出產(chǎn)的天然冰片,這使得以前天然冰片來源稀缺的問題得到了解決,因此冰片(合成龍腦)有被天然冰片逐漸取代入藥的趨勢。近年來關于天然冰片研究的報道相對較少,僅有張伯禮等對其進行安全性和藥效學方面的對比研究,認為與合成龍腦相比,天然冰片的安全性可以得到保證;但關于天然冰片的在生物體內(nèi)的分析和藥動學研究鮮見報道。本研究進行了天然冰片在動物體內(nèi)的GC-MS分析,結(jié)果表明,天然冰片在動物(小鼠、大鼠和家兔)體內(nèi)有轉(zhuǎn)化(或代謝)為樟腦的可能。經(jīng)對天然冰片原料藥、空白對照,以及變換各種組合條件后的GC-MS分析,可以證實給小鼠灌服天然冰片后在體內(nèi)可檢測到樟腦,這提示冰片在體內(nèi)有可能通過某種代謝機制轉(zhuǎn)化為樟腦。由于樟腦具有一定毒性,特別對嬰幼兒毒性更大,因此本研究結(jié)果在一定程度上可用來解釋《中國藥典》中對“冰片(合成龍腦)”中“注意:孕婦慎用”的禁忌內(nèi)容,以及加拿大衛(wèi)生部慎用“秘制保嬰丹”通知的部分原因,本研究可以總結(jié)出如下結(jié)論:不是因冰片的結(jié)構(gòu)與樟腦相似具有毒性,而是冰片可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為樟腦,因而具有一定毒性。因此,本研究結(jié)果可對進一步考察天然冰片的安全性具有一定的參考價值。為此,本研究建議在《中國藥典》的“天然冰片(右旋龍腦)”項目中增加與“冰片(合成龍腦)”同樣的注意事項(即“注意:孕婦慎用”),以保證用藥的安全。2.本研究對不同溶劑制成的天然冰片混懸液給小鼠灌服后的體內(nèi)成分進行了GC-MS分析,結(jié)果表明,無論采用CMC-Na,還是