瓊產艾納香葉精油的gc-ms分析

瓊產艾納香葉精油的gc-ms分析

蜂蜜是純度、復雜、富含香味的植物精華成分。它通常具有抗菌、抗炎、止癢、安神等功能，并在醫(yī)藥、食品、護理和口腔護理行業(yè)應用。艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC.)為菊科(Asteraceae)植物,廣泛分布于中國貴州、云南、廣西、海南以及東南亞多個國家。艾納香在中國南方作為傳統(tǒng)民族草藥已有悠久歷史,醫(yī)書記載艾納香具有治療風濕性關節(jié)炎、產后痛風、濕疹、皮炎等疾病。在東南亞,艾納香常被用來熏蒸沐浴,添加到煙草和茶飲料中,并作為草藥用于緩解產后痛風及防治皮膚病等。艾納香精油在民間被認為是艾納香的精華所在,因其獨特香氣和記載的藥用作用(消炎、消腫、止痛等)受到香精香料和醫(yī)療美容及化妝品行業(yè)親睞。目前,中國、孟加拉和泰國的多位學者研究了中國貴州、云南、廣西和泰國、孟加拉產艾納香揮發(fā)油的化學組成和抗菌及驅蟲活性。這些學者多研究艾納香揮發(fā)油,Bhuiyan等利用Clevenger裝置提取泰國和孟加拉產艾納香葉精油,并分析其化學組成。我國的海南島因氣候環(huán)境適宜艾納香生長,全島廣泛分布,蘊藏量豐富,海南也成為即貴州之后又一個重要的艾納香產地。本研究利用GC-MS分析瓊產艾納香葉精油的化學組成,通過DPPH自由基清除試驗、β-胡蘿卜素漂白試驗和硫代巴比妥酸法研究其抗氧化活性,通過抑菌圈和最小抑菌濃度2個指標考察其抗菌活性。1材料和方法1.1化學試劑及儀器艾納香葉,采自海南省五指山,自然陰干進行破碎處理得干艾納香葉粉末;金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、假絲酵母、黃曲霉,均購于廣東省微生物研究所;DPPH、正己烷(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司;C8-C22正構烷烴,美國Accustand公司;TBHQ、Ve、Vc、β-胡蘿卜素、亞油酸、吐溫40、AAPH、硫代巴比妥酸、十二烷基磺酸鈉、慶大霉素、酵母浸膏、牛肉膏蛋白胨、葡萄糖、NaCl、瓊脂條等,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。SW-CJ-2C超凈工作臺,蘇州凈化設備廠;Varian1200LGC/MS-MS氣相色譜質譜聯用儀,美國Varian公司;DB-5彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm,0.25μm),美國Agilent公司。1.2實驗方法1.2.1精油的提取稱取50g艾納香葉粉末,置于2L蒸餾瓶中,再加入1L蒸餾水,使用Clevenger氏裝置通過水蒸氣蒸餾法提取精油,蒸餾6h后收集裝置中的油相。以上試驗重復8次,將每次收得的精油集中并加入無水硫酸鈉進行干燥,過濾后得到具有濃郁香氣的艾納香葉精油,得率為0.62%。1.2.2萃取條件及質譜將提取的艾納香葉精油溶解于正己烷(色譜純),配置成濃度為200μg/mL待測樣,利用GC-MS對其進行分析,確定其主要化學成分及其相對含量。升溫程序,初溫40℃保持1min,然后以5℃/min升至280℃,保持5min;進樣口溫度250℃;載氣(He)流速1.0mL/min。萃取頭在進樣口于250℃解析3min。質譜條件,電子轟擊離子源(EI),離子源溫度200℃,電子能量70eV,發(fā)射電流35μA,檢測器電壓1000V,接口溫度280℃,掃描質量范圍50~500amu。化合物定性采用保留指數和質譜圖對照2種方法。化合物的保留指數是根據其保留時間與C8-C22正構烷烴的保留時間按照保留指數計算公式計算而得;采集到的質譜圖與NIST和Wiley標準譜庫對照,對組分定性,僅報道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鑒定結果。用峰面積歸一法計算各化學成分的相對含量。1.2.3艾納香葉蠟的抗逆性1.2.3.dpph乙醇溶液配制通過DPPH自由基清除率表現艾納香葉精油的抗氧化活性。配制濃度分別為1、2、4、6、8、10、15、20和40g/L的受試樣品乙醇溶液。分別取1mL受試品溶液與2mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液混合,立刻于517nm處測定吸光度,在避光處靜置1h,再測吸光度,不加樣的DPPH乙醇液為空白樣。實驗平行測定3次。自由基清除率按下式計算:式中:AC(0),t=0時的空白吸光度,AC(t),測試樣在t=1h時的吸光度。1.2.3.抗氧化能力的測定將0.1mgβ-胡蘿卜素用10mL三氯甲烷于圓底瓶中溶解,加入20mg亞油酸和100mg吐溫40,然后于50℃旋轉真空干燥。加入50mL含氧蒸餾水,在超聲波中形成乳化液A。取200μL濃度分別為0.1,0.5,1,2,4,6和8g/L的受試樣品乙醇液與5mL乳化A液于試管中混合,等量乙醇代替作為空白樣。在50℃保溫,于470nm測定吸光度。測定平行3次?？寡趸视孟率接嬎?。式中:AA(120),測試物在t=120min時的吸光度,AC(120),空白在t=120min是的吸光度,AC(0),空白在t=0min時的吸光度。1.2.3.抗氧化指數測定方法分別取0.1mL濃度為10,20,40g/L的樣品乙醇液與0.5mL蛋黃乳濁液混合,加入0.05mL的AAPH自由基溶液(0.07mol/L)引發(fā)脂質過氧化反應。隨后即加入1.5mL乙酸溶液(20%,pH3.5)和1.5mL濃度為0.8%硫代巴比妥酸液(用11g/L)十二烷基硫酸鈉溶液配制),振蕩均勻。不加精油樣品的為空白樣。然后于95℃水浴保持60min。冷卻后,每個試管中加入5mL正丁醇,充分萃取,于1200g離心15min。傾出有機層在532nm處測定吸光度值。測定平行3次?？寡趸笖礎I用下式計算。式中:AC,完全氧化空白的吸光度,AT,測試樣品的吸光度。1.2.4艾納香葉蠟的抗菌活性研究1.2.4.菌種培養(yǎng)及培養(yǎng)將受試細菌菌株按1∶100接種活化,在固體LB培養(yǎng)基上劃線,37℃培養(yǎng)24h后,挑取單個菌落,接種到液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)18h。采用麥氏比濁法將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋到合適濃度,本實驗中菌液濃度為106CFU/mL。將受試真菌菌株用液體SDA培養(yǎng)基使菌種融化分散,30℃培養(yǎng)24h,在SDA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48~72h。將孢子刮入吐溫80生理鹽水溶液作為母液,調整濃度為106CFU/mL。1.2.4.抑菌圈直徑測定濾紙片(6mm)經滅菌后,分別點上5μL精油DMSO溶液,無菌條件下貼在涂有菌液的固體培養(yǎng)基上,并用DMSO做空白對照,細菌在37℃下培養(yǎng)24h后測抑菌圈直徑,真菌在30℃下培養(yǎng)48~72h后測抑菌圈直徑,每種受試物6次重復。1.2.4.最小抑菌濃度測定用固體培養(yǎng)基以二倍稀釋法對精油進行梯度稀釋,稀釋成13個2倍系列濃度,最后一平皿不加精油作為陰性對照,并用DMSO做空白對照。最后點上配置的菌懸液。細菌在37℃下培養(yǎng)24h,真菌在30℃下培養(yǎng)48~72h,無明顯菌落生長的平皿的精油濃度即為精油的最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)。試驗平行3次。2結果與分析2.1gc-ms精油聯合GC-MS技術對艾納香葉精油進行分析,通過質譜庫檢索和保留指數比對分析,檢出精油的成分組成見表1。初步定性組分45種,其中有37種屬于萜類化合物,單萜19種(48.55%),倍半萜18種(39.91%)。在單萜中,萜烯種類最多,共10種(8.65%);萜醇相對含量最高,6種總含量達29.95%;其他依次為萜酮2種(9.64%),萜酯1種(0.31%)。在倍半萜中,萜烯種類最多,共10種,相對含量也最高,達到37.59%;另一類是萜醇8種(2.32%)。圖1為精油的GC-MS總離子圖。精油的相對含量前5位的組分分別是(-)-龍腦(28.45%)、石竹烯(22.98%)、樟腦(9.56%)、α-蓽澄茄烯(8.32%)和β-蒎烯(4.32%)。這些組分賦予了艾納香葉精油濃郁的中藥香氣,主體表現為樟腦香和草藥香氣。目前已有多個產地的艾納香揮發(fā)油或精油的化學成分報道,如貴州羅甸產艾納香揮發(fā)油主要含有(-)-龍腦(57%)、石竹烯(8%)和樟腦(5%);廣西南寧產艾納香精油主要成分是(-)-龍腦(12%)、1,8-桉葉醇(20%)、石竹烯(10%)和樟腦(8%);云南普洱產艾納香揮發(fā)油主要成分是(-)-龍腦(52%)和樟腦(18%);泰國產艾納香精油主要成分是(-)-龍腦(25%)和樟腦(20%);孟加拉產艾納香精油的主要成分是(-)-龍腦(33%)、石竹烯(8%)、喇叭茶醇(7%)和氧化石竹烯(4%)。本研究中瓊產艾納香葉精油與以上多個產地的艾納香揮發(fā)油或精油比較后發(fā)現,瓊產艾納香葉精油中(-)-龍腦相對含量依然是最高的,但并未超過半數,而其石竹烯、α-蓽澄茄烯和β-蒎烯的相對含量都是其他揮發(fā)油或精油所不具備的高含量,這說明瓊產艾納香葉精油具有主要成分豐富的特點,也可能給其帶來獨特的活性特征。這些組分已經被報道具有抗氧化和抗菌的等活性,艾納香葉精油也可能具有這類活性,下面就對艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性進行初步研究。2.2瓊產艾納香葉精油清除dpph自由基能力的檢測抗氧化物主要通過兩種機制清除自由基,即氫原子轉移(HAT)和電子轉移(SET)。沒有某種單一的測試方法足以評價樣品的抗氧化活性,所以需要多種方法應用于樣品的抗氧化試驗中。通過DPPH自由基清除試驗、β-胡蘿卜素漂白試驗和硫代巴比妥酸法研究瓊產艾納香葉精油的抗氧化活性,同時與商業(yè)化抗氧化劑水溶性Vc、VE、TBHQ比較效果。DP-PH自由基是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基,DPPH自由基清除能力是一種最常見的衡量化合物抗氧化活性指標,廣泛應用于定量測定生物樣品和食品等物質的抗氧化能力。DPPH自由基清除實驗屬于SET類方法,DPPH自由基有單電子,當有自由基清除劑存在時,與其單電子配對而使褪色,褪色程度與其接受電子的數量成線性定量關系,因而可用分光光度計快速定量分析。由圖2可知,艾納香葉精油對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強,在1~20mg/mL濃度內成線性關系。從表2發(fā)現,Vc、VE和TBHQ3種商業(yè)化的強抗氧化劑的DPPH自由基清除能力很高,而且效果接近,IC50在11~14μg/mL;而瓊產艾納香葉精油對DPPH自由基清除率的IC50為11.26mg/mL。精油的DPPH自由基清除能力與強抗氧化劑相比效果差距巨大,但是也表現出了一定的抗氧化活性,可推測電子轉移作用機制不是其抗氧化作用的主要機制。β-胡蘿卜素漂白(BCB)試驗主要是評價抗氧化物質在乳化脂質體系中抑制脂質氫過氧化前期的能力,屬于HAT類方法。圖3為采用β-胡蘿卜素漂白法測定的瓊產艾納香葉精油抗氧化活性。表2為幾種抗氧化物活性的比較,在脂質體系中醇溶性的VE是公認的強抗氧化劑,在本試驗條件下,VE再現出極強的抗氧化性,其半抑制濃度IC50約為0.017g/L。但是作為強抗氧化劑的水溶性Vc幾乎不顯現其抗氧化活性,未能測出其IC50值。這種現象稱為脂質體系中的“極性反?！?polarpara-dox),其原因是由于水溶性極性物質在乳化脂質體系中主要集中在水相,而脂相中的濃度極低。瓊產艾納香葉精油在高濃度時也表現出較好的抑制β-胡蘿卜素漂白的活性,IC50約為3.55g/L。與2種強抗氧化劑比較發(fā)現,精油的IC50值與強抗氧化劑之間的差距較DPPH自由基清除試驗縮小,說明精油在脂質體系中表現出更強的抗氧化活性。硫代巴比妥酸法(TBARS)主要衡量的是抗氧化劑清除能導致脂質過氧化的自由基的能力,同時也能衡量弱親脂性抗氧化劑的抗氧化能力,屬于HAT類方法,此法也被認為是最接近真實環(huán)境的測試方法。由于水溶性抗氧化劑會出現“極性反常”現象,所以該法僅對瓊產艾納香葉精油和脂溶性的VE、TBHQ進行測試。如表3所示,精油和其他抗氧化劑的抗氧化指數均隨受試濃度的升高而上升,同時還發(fā)現精油與VE和TBHQ的差距并未表現出DPPH和BCB試驗中巨大的差距。精油表現出的抗氧化活性主要來源于其中萜烯類化合物,如石竹烯等。從3個測試結果看,精油抗氧化作用機制主要是氫原子轉移作用,電子轉移作用較弱。雖然精油的抗氧化能力與公認的強抗氧化劑仍存在差距,但是TBARS結果說明瓊產艾納香葉精油在接近真實環(huán)境的體系中表現出了較強的抗氧化能力?？梢哉J為瓊產艾納香葉精油作為一種純天然產物,具有成為保健食品和化妝品等高檔產品中天然抗氧化添加劑的潛力。2.3不同品種植物精油的抑菌活性植物精油普遍表現出了抗菌性能,但是不同精油對不同菌種的抑制能力存在差異,需要做詳細的研究。選用2種革蘭氏陽性細菌,2種革蘭氏陰性細菌和2種真菌作為測試菌,通過抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)2個指標對瓊產艾納香葉精油的抑菌活性進行初步研究。由表4可知,比較抑菌圈發(fā)現精油對革蘭氏陽性細菌的抑制效果明顯好于陰性細菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強。對真菌的抑制效果略強于細菌,對假絲酵母的抑制能力稍強于黃曲霉。比較MIC發(fā)現精油對真菌的抑制能力明顯強于細菌,2種真菌的MIC都是625μg/mL,對金黃色葡萄球菌抑制效果較好(625μg/mL),對其他3種細菌的抑制能力相對較弱(2500μg/mL)。據泰國學者研究發(fā)現,泰國產艾納香精油對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌都沒有表現出抑菌活性,僅對革蘭氏陽性菌蠟樣芽孢桿菌(MIC:0.15mg/mL)和金黃色葡萄球菌(MIC:1.2mg/mL)