腎氣虛狀態(tài)下大鼠氧自由基損傷程度和端粒長度的變化

腎氣虛狀態(tài)下大鼠氧自由基損傷程度和端粒長度的變化

端粒是真核細(xì)胞中染色體末端的蛋白質(zhì)-dna結(jié)構(gòu)，在保護染色體完整性和維持細(xì)胞復(fù)制能力方面發(fā)揮著重要作用。隨著連續(xù)細(xì)胞分裂，端粒逐漸縮小，細(xì)胞老化死亡。端粒長度目前已被公認(rèn)為是觀察人體衰老的微觀指標(biāo)。中醫(yī)認(rèn)為脾虛在衰老中占有重要地位,前期研究認(rèn)為脾氣虛是脾虛的早期狀態(tài)。脾氣虛則“脾失健運”導(dǎo)致免疫功能紊亂,代謝功能下降,“樞機不利”則導(dǎo)致自由基的損傷。而自由基損傷引起DNA共價鍵的斷裂和鏈分離,端粒也不能幸免。本項研究以自由基損傷學(xué)說和端粒學(xué)說為切入點,通過觀察脾氣虛證模型大鼠腦皮質(zhì)及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)含量和腦皮質(zhì)端粒長度的變化情況,為揭示臟象學(xué)說中脾氣虛證的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵提供新的科學(xué)事實和實驗依據(jù),為人類抗衰老提供新的防治手段。1材料和方法1.1dna提取試劑盒考馬斯亮蘭蛋白測定盒(南京建成生物工程研究所);SOD測定盒(南京建成生物工程研究所);GSH-PX測定盒(南京建成生物工程研究所);MDA測定盒(南京建成生物工程研究所);T-AOC測定盒(南京建成生物工程研究所);端粒長度檢測試劑盒(Roche);DNA提取試劑盒(大連寶生物);帶正電荷尼龍膜(美國密理博);雜交袋(Roche)。1.2方法1.2.1平均體重g健康SD雌性大鼠,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,平均體重(180.6±8.93)g。隨機分為2組:正常對照組和脾氣虛模型組,每組20只。1.2.2大鼠一般情況根據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學(xué)理論,采用兩種造模因素復(fù)合應(yīng)用:(1)飲食不節(jié):單日喂甘藍(lán),禁食,雙日胃飼精煉豬油脂。(2)疲勞過度:游泳至耐力極限。第1~14d,單日喂食甘藍(lán),不限量,禁食,自由飲水,游泳至耐力極限(耐力極限系指大鼠四肢劃動無力,身體豎立,整個頭部浸入水中超過10s);雙日胃飼豬油脂每只2mL/100g體重。第15d,應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)模式識別方法對脾氣虛證模型大鼠進行綜合評價,將符合標(biāo)準(zhǔn)的脾氣虛證模型大鼠納入脾氣虛證模型組。1.2.3腦皮質(zhì)組織的制備各組動物造模結(jié)束后,用10%水合氯醛按0.35mL/100g體重的劑量麻醉動物,用10mL注射器進行腹主動脈取血后,迅速取出腦皮質(zhì)組織,用精密天平準(zhǔn)確稱量腦皮質(zhì)組織重量,每個組織塊按1∶9的比例加冰生理鹽水充分勻漿,配制成10%的組織勻漿液,3000r/min離心10min后,取上清液置Eppendorf管中,放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。血液放?h后,3000r/min離心10min后,取上清液放入Eppendorf管中,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩７謩e按照SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA試劑盒的操作步驟完成測定。1.2.4腦皮質(zhì)dna的提取和純化造模結(jié)束后,用10%水合氯醛按0.35mL/100g體重的劑量麻醉動物,在冰上迅速取出腦皮質(zhì)組織各0.05~0.1mg,冰生理鹽水洗去血液,濾紙吸干水分。(1)DNA提取:取0.05~0.1mg的腦皮質(zhì)組織移入冰浴預(yù)冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊狀;加入350μL的SolutionA和0.9μL的RNaseA1后用快速研磨成勻漿;充分振蕩混勻后,65℃保溫5min;加入400μL的SolutionB,振蕩混合;加入1mL4℃預(yù)冷的SolutionC,充分混勻后,12000r/min離心2min;棄去上層有機相,再加入1mL的4℃預(yù)冷的SolutionC,充分混勻后,12000r/min離心2min;棄去上層有機相,然后將水相溶液(無色下層)轉(zhuǎn)移至置于CollectionTube上的FilterCup中,12000r/min離心1min;棄FilterCup,在濾液中加入400μL的DBBuffer,混合均勻;將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上,將上述操作6混合溶液轉(zhuǎn)移至CollectionTube中,12000r/min離心1min,棄濾液;將500μL的RinseA加入至SpinColumn中,12000r/min離心30s,棄濾液;將700μL的RinseB加入至SpinColumn中,12000r/min離心30s,棄濾液;重復(fù)操作步驟9;將SpinColumn安置于新的1.5mL的離心管上,在SpinColumn膜的中央處加入50~200μL的滅菌蒸餾水,室溫靜置1min;12000r/min離心1min洗脫DNA。用蛋白核酸分析儀檢測腦皮質(zhì)DNA含量。(2)端粒長度的檢測(Southern雜交):各檢測樣品分別取1μgDNA用限制性內(nèi)切酶HinfI/RsaI各1μL,37℃消化2h;然后用1×TAE緩沖液制備0.8%瓊脂糖凝膠(15cm×10cm),上樣20μL,75V,電泳4h。然后將凝膠依次進行下列處理:0.25mol/LHCI脫嘌呤10min,去離子水漂洗2次;1.5mol/LNaCI、0.5mol/LNaOH中變性,去離子水漂洗2×15min;3mol/LNaCI、0.5mol/LTris-HCI(pH7.5)中和2×15min;采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移至正電荷尼龍膜上,用20×SSC做轉(zhuǎn)移液,過夜;次日將膜放入兩層濾紙之間,120℃烘烤20min;取出膜,在2×SSC中漂洗2次;將膜放入雜交袋,先加入預(yù)雜交液約18mL,輕搖孵育,42℃,50min;然后棄去預(yù)雜交液,立即加雜交液,輕搖孵育,42℃,3h(雜交液內(nèi)含適量的以地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針);然后用嚴(yán)緊型清洗緩沖液Ι漂洗雜交膜,100mL,2×5min;再用預(yù)熱的嚴(yán)緊型清洗緩沖液Ⅱ漂洗雜交膜,100mL,50℃,2×15min;用100mL清洗緩沖液漂洗膜5min;將膜放在100mL阻斷溶液中孵育30min;加入含Anti-Dig-Ap的工作液100mL孵育30min;用清洗緩沖液漂洗膜,200mL,2×15min;在100mL檢測液中孵育膜2~5min;棄去檢測緩沖液,將有DNA的一面向上平放,很快加入40滴(約30mL)底物溶液,驅(qū)除氣泡,孵育5min;于暗室中將X線片覆蓋在膜上,暗盒固定,曝光10~20min,用UV-2000紫外分析儀對顯影后的X線片進行掃描,并用Gis-120D數(shù)碼處理系統(tǒng)(上海天能)進行分析。用TRF=∑(ODi)/∑(ODi/Li)(ODi為雜交帶i處光密度,Li為i處DNA分子大小)計算出端粒長度。1.3統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)用x—±s表示。實驗結(jié)果采用SPSS11.5版本進行處理。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1gsh-px活性、gsh-aoc活性變化與正常組相比,脾氣虛模型組大鼠血清和腦皮質(zhì)中SOD活性顯著降低(P<0.05),GSH-Px活性顯著降低(P<0.05),T-AOC顯著降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05)。見表1。2.2脾虛模型中大鼠段粒的長度變化脾氣虛模型組大鼠腦皮質(zhì)中端粒長度顯著降低,與正常組比較有明顯差異(P<0.05)。見表2。3油氣虛證動物模型的制備端粒是近幾年生命科學(xué)研究的熱點。實驗研究發(fā)現(xiàn)在某些組織中,老年人的端粒比年輕人的短,端粒長度已經(jīng)成為衰老研究的主要微觀指標(biāo)。中醫(yī)認(rèn)為脾虛在衰老中占有重要地位。脾虛運化功能減退,水谷精微不能充分營養(yǎng)肢體,失去正常生理活動,導(dǎo)致衰老?，F(xiàn)代很多實驗研究也發(fā)現(xiàn),在衰老的進程中,機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)逐步降低,并且自由基及其分解產(chǎn)物在體內(nèi)積聚。因此端粒、氧自由基與脾虛相關(guān)的分子生物學(xué)機制之間可能存在著密切的關(guān)系。本項研究從脾氣虛證出發(fā),以飲食不潔,勞倦過度復(fù)合因素結(jié)合復(fù)制出脾氣虛證動物模型。實驗發(fā)現(xiàn),與正常組相比,脾氣虛模型組大鼠體內(nèi)MDA含量顯著升高(P<0.05),說明脾氣虛狀態(tài)下機體有明顯的氧自由基損傷。生物體在其長期進化過程中,為防御氧自由基的損傷和破壞,組織和細(xì)胞建立了一整套完善的抗氧化防御系統(tǒng),包括作為大分子清除劑的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化物系統(tǒng),如SOD、T-AOC、GSH-Px。實驗發(fā)現(xiàn),模型大鼠血清和腦皮質(zhì)SOD、GSH-Px、T-AOC含量與正常組比較有顯著下降(P<0.05)。本實驗研究結(jié)果顯示,脾氣虛模型組大鼠腦皮質(zhì)中端粒長度顯著降低,且與正常對照組比較有