運(yùn)動疲勞對大鼠脾胃虛證模型骨骼肌肌原纖維和線粒體結(jié)構(gòu)的影響

運(yùn)動疲勞對大鼠脾胃虛證模型骨骼肌肌原纖維和線粒體結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞形態(tài)測量：使用拳頭角色圖像分析儀對骨關(guān)節(jié)痛細(xì)胞的平均橫截面積（）、原體纖維（mf）、骨瘦粉（mi）和顆粒（na）的體密度進(jìn)行測量。檢測條件為:物鏡×40,投影透鏡×1.25,燈電壓5.54V,靈敏度1.01。每張切片或照片觀察5個參照系上的圖象截面積。1.肌細(xì)胞A:冰凍切片,經(jīng)酸、鹼溶液預(yù)孵育后肌球蛋白腺苷三磷酸酶(M-ATPase)染色,切片放大20倍,輸入圖象分析儀測量。2.線粒體、肌原纖維Vv:每塊超薄切片隨機(jī)拍3張照片,負(fù)片原始放大倍數(shù)5000倍。3.線粒體NA:每塊超薄切片隨機(jī)拍3張照片.負(fù)片原始放大倍數(shù)5000倍。結(jié)果1社會學(xué)觀察1.1光鏡觀察1.2不同重建組的肌原纖維和感染肌對照組大鼠實驗期間骨骼肌超微結(jié)構(gòu)正常(圖1)。脾氣虛組的肌原纖維粗細(xì)不均勻,間隙增寬,肌絲排列松散,肌原纖維的部分肌節(jié)由于Ⅰ帶細(xì)絲剪斷樣破壞而Z帶分離。線粒體數(shù)量減少,體積明顯增大(圖2),高倍電鏡下可見線粒體膜部分消失,線粒體嵴減少,排列紊亂,基質(zhì)內(nèi)側(cè)形成多數(shù)電子透明區(qū),使基質(zhì)呈斑點狀甚至空泡狀。肌漿網(wǎng)擴(kuò)張(圖3)。扶正健脾組的肌原纖維排列整齊,線粒體數(shù)量增多,個別地方仍可見到膨脹的線粒體(圖4)。線粒體嵴較密集,基質(zhì)較均勻,肌漿網(wǎng)未見擴(kuò)張。自然恢復(fù)組的肌原纖維較扶正健脾組為細(xì),線粒體數(shù)量較少,部分線粒體膨脹明顯(圖5)。膨脹的線粒體內(nèi)嵴斷裂,或形成空泡。2兩組纖維類型的對比利用M-ATPase染色將肌纖維分為Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維,用圖象分析儀對兩種肌纖維的進(jìn)行測量。脾氣虛組Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維的均小于對照組,P<0.01,其中以Ⅱ型纖維的下降最為顯著。扶正健脾組與自然恢復(fù)組的肌纖維A均較脾氣虛組增加,但扶正健脾組的增加明顯,與自然恢復(fù)組比較P<0.01,其中Ⅰ型纖維的A在健脾益氣藥物復(fù)健后,已恢復(fù)到對照組水平,Ⅱ型纖維的恢復(fù)則較Ⅰ型纖維緩慢(見表1)。2.2coor2.3sundownvv2.4原始纖維vv脾健治療藥在調(diào)濕和保健體治療前后的糖凝本研究應(yīng)用光鏡、電鏡及形態(tài)測量手段,對脾氣虛證時肌細(xì)胞的變化進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)在脾氣虛時,骨骼肌的變化主要表現(xiàn)為:線粒體的結(jié)構(gòu)發(fā)生異常。骨骼肌收縮活動的能量主要由骨骼肌細(xì)胞中的線粒體提供,在線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)中,含有進(jìn)行氧化作用的呼吸鏈的酶體系,氧化磷酸化酶體系及氧化脂肪酸及糖類的酶體系。線粒體的功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān),在脾氣虛時,線粒體的形態(tài)與數(shù)量均發(fā)生了變異。對脾氣虛證大鼠形態(tài)測量的結(jié)果表明:伴隨著肌原纖維間線粒體NA的減少,線粒體的Vv增加。結(jié)合觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)線粒體的大小不一,膨脹的線粒體均為正常線粒體的數(shù)倍,線粒體內(nèi)膜破壞。嵴減少或消失,有的形成空泡?；|(zhì)顆粒密度下降。這些現(xiàn)象說明:“脾氣虛”的病理機(jī)制之一為骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷。對脾氣虛證大鼠模型進(jìn)行藥物復(fù)健和自然恢復(fù)的對比觀察后發(fā)現(xiàn),自然恢復(fù)組的線粒體損傷在超微結(jié)構(gòu)上有所恢復(fù),線粒體的膨脹程度較脾氣虛組減輕,線粒體內(nèi)膜及嵴的損傷亦減輕,但形態(tài)測量時與脾虛組無統(tǒng)計學(xué)差異,提示線粒體損傷的自然恢復(fù)可能需要較長的時扶正健脾組經(jīng)健脾益氣藥物復(fù)健后,超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)膨脹的線粒體基本消失,線粒體內(nèi)膜和嵴得到修復(fù),線粒體的NA與Vv均接近于對照組,這一結(jié)果證實了脾氣虛證與線粒體結(jié)構(gòu)、功能之間的關(guān)系,也顯示了健脾益氣藥物具有縮短脾氣虛證時損傷的線粒體修復(fù)時間的作用。2肌肉組織的蛋白代謝呈負(fù)平衡狀態(tài),肌纖維明顯變細(xì)。根據(jù)對Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維的測量,脾氣虛組大鼠兩種肌纖維的均下降,其中Ⅰ型纖維較對照組下降了33%,Ⅱ型纖維下降了67%。復(fù)健后,扶正健脾組的肌纖維增加。Ⅰ型纖維的A超過對照組4%;Ⅱ型纖維的雖較脾氣虛組增加了一倍,但與對照組相比仍有明顯差異,P<0.01,說明肌纖維的蛋白質(zhì)分解以Ⅱ型纖維為著。骨骼肌蛋白質(zhì)的分解加強(qiáng),反映了在脾氣虛狀態(tài)時,機(jī)體的代謝異常不僅表現(xiàn)在能量代謝方面,也影響到物質(zhì)代謝。骨骼肌的上述病理改變,是脾氣虛時肌肉不耐疲勞和劇烈運(yùn)動的原因之一。健脾益氣藥物對脾氣虛導(dǎo)致的線粒體改變有良好的恢復(fù)作用,這不但證實了脾與肌肉之間的生理、病理聯(lián)系,也為通過健脾法提高肌肉的能量代謝水平提供了線索。(本文承中日友好醫(yī)院電鏡室協(xié)助制作電鏡切片,中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測試中心圖象分析室協(xié)助進(jìn)行圖象分析,謹(jǐn)此致謝。)中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為:脾主肌肉,即脾的生理功能之一為主肌肉的發(fā)育和運(yùn)動。脾氣充盛,則肌肉強(qiáng)健有力;脾氣虛弱,則肌肉萎弱無力。臨床的脾氣虛證患者常出現(xiàn)四肢困倦乏力,不耐疲勞,肌肉消瘦等癥狀。為了探討脾氣虛證與肌肉之間的關(guān)系,我們利用大鼠脾氣虛證模型,對脾氣虛狀態(tài)時骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)變化進(jìn)行了研究。不同給藥大鼠的肌原纖維vv和線粒體vv動物模型及分組:Wistar雄性大鼠60只,體重180±20g,隨機(jī)分為對照組、脾氣虛組、扶正健脾組和自然恢復(fù)組(每組15只)。運(yùn)用本室建立的以瀉下和運(yùn)動疲勞因素塑造大鼠脾氣虛證模型的方法造模。造模3周后(第22天),處死對照組與脾氣虛組。動物模型的復(fù)健方法為:扶正健脾組大鼠服用健脾益氣的藥物“扶正健脾液”(口服液,每ml含生藥1g),每日5ml,連續(xù)7日。自然恢復(fù)組大鼠不服藥。扶正健脾組與自然恢復(fù)組在復(fù)健1周后(造模第29天)處死。組織標(biāo)本制備:大鼠乙醚麻醉后斷頭處死,光鏡檢查每組取動物5只,自左側(cè)跖淺屈肌固定部位取材,于液氮預(yù)冷的異戊烷內(nèi)驟冷10秒鐘,冰凍切片8μm厚。電鏡檢查每組取動物3只,取材部位為左側(cè)比目魚肌,隨機(jī)取4個縱切面包埋塊作超薄切片,用H-600型透射電鏡觀察、拍片。脾氣虛組的肌原纖維Vv小于對照組,P<0.001。扶正健脾組與自然恢復(fù)組相比,P<0.001。扶正健脾組的肌原纖維Vv基本恢復(fù)到正常水平(見表2)。脾氣虛組與對照組相比,線粒體Vv增加,P<0.001。扶正健脾組線粒體Vv基本接近于對照組,兩者相比P>0.05。自然恢復(fù)組線粒體Vv和脾氣虛組近似,與扶正健脾組相比P<0.001(見表2)。脾氣虛組線粒體的NA較對照組降低,P<0.01。扶正健脾組線粒體NA高于自然恢復(fù)組,P<0.05(見表2)。2.1比目魚肌