黃芪建中湯對(duì)脾胃及免疫功能的影響

黃芪建中湯對(duì)脾胃及免疫功能的影響

現(xiàn)代研究表明，黃鼠狼的抗癲癇藥物可以減少對(duì)藥物的反應(yīng)，具有明顯的氧化作用，抑制組織中表皮生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子的過(guò)度表達(dá)，并抑制腫瘤的形成。cyclinD1為目前公認(rèn)的癌基因,其過(guò)度表達(dá)時(shí)使細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短,導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控,從而發(fā)生癌變。為進(jìn)一步明確黃芪建中湯對(duì)免疫功能的影響及抑制腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立脾氣虛Lewis肺癌模型,研究黃芪建中湯對(duì)脾氣虛肺癌小鼠免疫功能及cyclinD1基因表達(dá)的影響。1材料和方法1.1動(dòng)物動(dòng)物房的飼養(yǎng)C57BL/6小鼠60只,雌性,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。小鼠Lewis肺癌瘤株,購(gòu)于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2g組成黃芪建中湯由芍藥18g,桂枝9g,炙甘草6g,生姜9g,大棗4枚,飴糖30g,黃芪9g組成。藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部中藥房,按《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算小鼠低、中、高劑量的等效劑量分別為:8.1、16.2、32.4g/kg體質(zhì)量,分別為成人劑量的6、12、24倍,按常規(guī)方法煎成湯劑,配制成生藥含量分別為0.324、0.648、1.296g/mL的藥液。1.3試劑盒和引物D-木糖試劑盒,南京建成生物工程研究所;胃泌素放免試劑盒,北京北方生物技術(shù)研究所;白細(xì)胞介素(IL)-2ELISAKIT試劑盒,上海晶美生物工程有限公司;cyclinD1引物,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;UV2000紫外分光光度計(jì),美國(guó)UNICO公司;2400型PCR儀,英國(guó)TECHNE公司產(chǎn)品;GIS-2008凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;UR-4100型酶標(biāo)儀,美國(guó)Dynaech公司。1.4對(duì)小鼠血清木糖、胃泌素的影響用C57小鼠60只常規(guī)飼養(yǎng)2d適應(yīng)環(huán)境后,取20只小鼠正常飼養(yǎng),其余40只小鼠采用苦寒瀉下法造脾氣虛模型(以100g大黃∶600mL蒸餾水的比例,于50℃水浴中浸泡8h,可得大黃浸泡液400mL。每只小鼠每日灌胃1mL,連續(xù)9d。從第5日起,小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動(dòng)、消瘦、拱背、精神萎糜等癥狀。第10日分別測(cè)正常組和模型對(duì)照組各10只小鼠血清木糖濃度及胃泌素水平,驗(yàn)證脾氣虛模型成功。脾氣虛模型建成后,正常組取10只和模型對(duì)照組40只小鼠接種腫瘤:在無(wú)菌條件下取接種14d的新鮮無(wú)壞死Lewis癌塊組織,制成單細(xì)胞懸液,0.9%氯化鈉注射液調(diào)整濃度至6×106個(gè)/mL,取0.2mL癌細(xì)胞原液,接種于小鼠的左腋下皮下。從取出腫瘤到移植完最后1只小鼠時(shí)間控制在2h之內(nèi)。1.5不同劑量黃芪基建湯的單次給藥C57BL小鼠接種24h后,隨機(jī)分為6組,每組10只。正常組、腫瘤對(duì)照組、模型對(duì)照組給以灌胃0.9%氯化鈉注射液0.5mL,每日1次,黃芪建中湯低、中、高劑量組分別給以低、中、高的黃芪建中湯0.5mL灌胃,每日1次。連續(xù)14d。1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)觀察小鼠的體質(zhì)量、飲食、行動(dòng)、精神食欲、行動(dòng)狀態(tài)、毛色、皮毛的光澤度等全身情況。給藥結(jié)束后第2日稱體質(zhì)量,眼球后取血,檢測(cè)血清木糖濃度及血清胃泌素水平;脫頸椎處死小鼠,無(wú)菌剝?nèi)×鰤K,保存于液氮中,RT-PCR法檢測(cè)cyclinD1的表達(dá)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示,計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用one-way方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(x±s)2結(jié)果2.1血清木糖濃度及胃泌素含量檢測(cè)見(jiàn)表1。從建立脾氣虛模型第5日起,小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動(dòng)、消瘦、拱背、精神萎靡等癥狀。造模第10日球后取血,檢測(cè)血清木糖濃度及胃泌素含量均低于正常,與正常組比較,差異非常顯著(P<0.01)(見(jiàn)表1)。同時(shí)在小鼠左腋下接種Lewis肺癌瘤株,小鼠于接種后第7~10日腋下出現(xiàn)大小不等的腫塊,以模型對(duì)照組較明顯;第15日處死小鼠,取血檢測(cè)血清木糖濃度及胃泌素水平驗(yàn)證脾氣虛模型仍存在,提示小鼠脾氣虛Lewis肺癌模型復(fù)制成功。2.2量組瘤質(zhì)量比較見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芪建中湯各劑量組瘤質(zhì)量均減輕,與模型對(duì)照組比較,差異顯著(P<0.05),以高劑量組抑瘤效果最佳(P<0.01)。2.3各組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的比較2.4clind-mr-na/創(chuàng)造值b見(jiàn)表4,圖1。黃芪建中湯中、高劑量組cyclinD1-mR-NA/GAPDH表達(dá)下降,以高劑量組最為顯著,與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3對(duì)免疫監(jiān)視的調(diào)控cyclinD1是G1期細(xì)胞周期素,主要作用是促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S檢查點(diǎn),cyclinD1對(duì)細(xì)胞周期G1期的調(diào)控是通過(guò)對(duì)抑癌基因蛋白pRb的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。pRb通過(guò)信號(hào)傳遞促進(jìn)cyclinD1基因表達(dá)。G1/S調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)控點(diǎn),決定細(xì)胞周期的時(shí)間。cyclinD1過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致G1/S期檢測(cè)點(diǎn)缺陷主要原因。檢測(cè)點(diǎn)功能缺陷可能會(huì)導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病,cyclinD1作為細(xì)胞周期重要的正調(diào)控因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾為后天之本,氣血生化之源”,有防御外邪侵害并自我恢復(fù)的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,其和機(jī)體免疫功能有著密切的聯(lián)系。如李艷等對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)T、B淋巴增殖反應(yīng),可使大黃煎液建立的脾虛小鼠不同程度地提高其體液免疫功能。杜雅薇等研究發(fā)現(xiàn)中藥組可不同程度提高大黃致脾虛泄瀉的SIgA、IL-2。而IL-2是最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子,并且可誘導(dǎo)或促進(jìn)多種細(xì)胞毒細(xì)胞活性,如自然殺傷細(xì)胞(NK)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)細(xì)胞,這些細(xì)胞在機(jī)體的免疫監(jiān)視免疫方面至關(guān)重要。王紅偉等發(fā)現(xiàn)脾虛機(jī)體的紅細(xì)胞C3b-受體花環(huán)率(C3b-RR)和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯降低,而Ic-RR明顯升高,提示紅細(xì)胞介導(dǎo)的消除循環(huán)免疫復(fù)合物及免疫黏附功能下降,從而導(dǎo)致脾虛時(shí)免疫功能的低下,淋巴細(xì)胞亞群比例的失調(diào),這在脾虛型惡性腫瘤患者中的表現(xiàn)較為明顯。肺癌病位在肺,病機(jī)為陰陽(yáng)不和,病本為正氣不足。癌著于身,易走竄耗傷氣血所致惡病質(zhì)居多。在中醫(yī)范圍內(nèi)又屬虛勞范疇。黃芪建中湯出自《金匱要略·血痹虛勞》“虛勞里急,諸不足,黃芪建中湯主之”,藥用黃芪、桂枝、芍藥、炙甘草、生姜、大棗、飴糖組成,功能在于燮理陰陽(yáng),培補(bǔ)脾氣,使谷氣充足,正氣旺盛。本實(shí)驗(yàn)提示黃芪建中湯組均有升高脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的作用