研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方法總結(jié)-實(shí)驗(yàn)步驟

研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方法總結(jié)-實(shí)驗(yàn)步驟蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)主要組成部分，蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)調(diào)控細(xì)胞及其信號(hào)有重要意義。把原來(lái)spaces空間上的一篇蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用研究方法轉(zhuǎn)來(lái)，算是實(shí)驗(yàn)技巧分類(lèi)目錄的首篇。(另補(bǔ)充2：\o"檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法比較"檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法比較)一、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，如果檢測(cè)到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說(shuō)明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒(méi)有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實(shí)際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。Angermayr等設(shè)計(jì)了一個(gè)SOS蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)?？梢匝芯磕さ鞍椎墓δ?，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定。二、噬茵體展示技術(shù)在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)時(shí)，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過(guò)柱，柱上若含目的蛋白，就會(huì)與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱(chēng)為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過(guò)程中通過(guò)適當(dāng)改變條件可以直接評(píng)價(jià)相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點(diǎn)。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)，并分離出了人上皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的信號(hào)分子。三、等離子共振技術(shù)表面等離子共振技術(shù)(SurfacePlasmonResonance，SPR)已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級(jí)的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測(cè)蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過(guò)程可實(shí)時(shí)監(jiān)控。測(cè)定快速且安全，還可用于檢測(cè)蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用;與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA和RNA的時(shí)空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET熒光顯微鏡有可能實(shí)時(shí)測(cè)量活體細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測(cè)量FRET效率以及供體與受體間距離的簡(jiǎn)單方法，僅需使用一組濾光片和測(cè)量一個(gè)比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串?dāng)_。該方法簡(jiǎn)單快速，可實(shí)時(shí)定量測(cè)量FRET的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP的供體受體對(duì)。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體芯片就是一個(gè)非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個(gè)領(lǐng)域里。六、免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀主要是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)，其基本原理是，在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細(xì)胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin”，因?yàn)镾PA\|Pansobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時(shí)就被分離出來(lái)。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開(kāi)。然后經(jīng)Westernblotting法，用抗體檢測(cè)目的蛋白是什么，是否為預(yù)測(cè)蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個(gè)缺陷：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。七、pull-down技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型有牢固型相互作用和暫時(shí)型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見(jiàn)，最好通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技術(shù)或Far-western法研究。Pull-down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細(xì)胞裂解液中此外還有交聯(lián)技術(shù)（cross－linKing），蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（Phagedisplay）以及生物信息學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點(diǎn)。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專(zhuān)一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記