鄰苯二酚加氧酶的發(fā)酵及提純1

鄰苯二酚加氧酶的發(fā)酵及用雙水相法的分離提純摘要：本實(shí)驗(yàn)以苯酚降解菌一種假單胞菌為菌種發(fā)酵獲得了可以降解苯酚的酶鄰苯二酚加氧酶，并以雙水相法加以提純。結(jié)果顯示，該假單胞菌經(jīng)過發(fā)酵獲得了鄰苯二酚加氧酶，在雙水相法萃取時(shí)選用PEG6000與不同體積的緩沖溶液融合后，只有當(dāng)PEG6000與緩沖液體積為1/1.6時(shí)，上下相及混合相酶活才存在。本實(shí)驗(yàn)為以雙水相法提取生物活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。引言：苯酚被大量用于制造酚醛樹脂以及其他高分子材料、藥物、燃料、炸藥等。隨著近年來工業(yè)對于苯酚的需求日益增加，苯酚對于環(huán)境的污染也日益加重［1］，這對人類也有極大的危害性。已有研究對微生物降解苯酚的途徑進(jìn)行了解釋［2］，也有對鄰苯二酚雙加氧酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究的報(bào)道［3］。降解苯酚的代謝是將苯酚分解為鄰苯二酚，鄰苯二酚由鄰位和間位途徑經(jīng)環(huán)裂解，最后形成2-羥粘糠酸半醛。鄰苯二酚加氧酶是降解本分的關(guān)鍵酶所以鄰苯二酚加氧酶在降解苯酚的途徑中起著重要的作用。雖然已經(jīng)有以雙水相萃取生物物質(zhì)［4］的報(bào)道，但還沒有以雙水相發(fā)萃取鄰苯二酚加氧酶的報(bào)道。自然界中，存在著許多具有降解芳香族化合物能力的細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)從化學(xué)工廠的污水中分離出能夠降解苯酚的假單胞菌。并以此菌進(jìn)行發(fā)酵，并將發(fā)酵后的產(chǎn)物用雙水相法進(jìn)行分離、提純出鄰苯二酚加氧酶。開展本實(shí)驗(yàn)，可以為以降解苯酚的工程菌進(jìn)行發(fā)酵、以雙水相法萃取直接得到降解苯酚的關(guān)鍵酶奠定基礎(chǔ)，以更加有效的方法改善污染。1材料與方法1.1材料供試菌為從污水中分離出的假單胞菌1.2培養(yǎng)基用假單胞菌生產(chǎn)鄰苯二酚加氧酶過程中使用的培養(yǎng)基及組成見表1表1?假單胞菌各階段培養(yǎng)基培養(yǎng)基種類 成份種子培養(yǎng)基富集培養(yǎng)培養(yǎng)基3gL-i牛肉膏+10gL-i蛋白胨+5gL-iNaCl+20gL-i(pH7.0)種子培養(yǎng)基富集培養(yǎng)培養(yǎng)基3gL-i牛肉膏+10gL-i蛋白胨+5gL-iNaCl(pH7.0)無機(jī)鹽培養(yǎng)基 6gL-iNaHPO+3gL-iKHPO+0.5gL-iNaCl+1gL-iNHCl+200mgL-i酵母膏+0.24gL-iMgS02 4 2 4 4 4+0.011gL-1CaCl(pH6.5-6.8)發(fā)酵培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基+500mgL-i苯酚1?3菌液制備將已經(jīng)分離得到的苯酚降解菌假單胞菌接到種子培養(yǎng)基上，在30°C下培養(yǎng)24h。之后將種子培養(yǎng)基上的菌體轉(zhuǎn)接至裝液量為50ml/250ml三角瓶中（10瓶/組），在37C下以200r/min搖瓶18h。在4-10C下以10000r/min的速度離心15min,共離心兩次。將得到的菌泥進(jìn)行碳饑餓培養(yǎng)。1?4苯酚降解菌的發(fā)酵培養(yǎng)、菌體細(xì)胞的收集及破碎50L的發(fā)酵罐中添加10L的發(fā)酵培養(yǎng)液，滅菌、冷卻后將至的的接種液接入發(fā)酵罐里，30°C,1:1（v/v）通風(fēng)量，攪拌速度為300r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h。發(fā)酵液在10°C下10000r/min離心5min收集細(xì)胞菌泥。菌泥用磷酸鹽緩沖液（pH7.5）沖洗兩次，重選在10-50ml相同緩沖液中，在冰浴條件下超聲破碎3min，功率300W,所得粗提物于4°C,10000r/min離心30min得上清液。1.5PEG6000與酶的共沉淀及復(fù)溶將酶粗提液在冰浴條件下先緩慢加入PEG6000并不斷攪拌混合均勻，靜置1h待PEG與酶混合穩(wěn)定后再加入固體（NH4）2SO4至飽和，低溫靜置6小時(shí)。然后再4°C、1000r/min離心10min，得到PEG與蛋白質(zhì)的鹽析復(fù)合沉淀物。PEG與蛋白質(zhì)的鹽析復(fù)合沉淀物分成5份（分別為1號1.62g、2號1.60g、3號1.61g、4號1.58g、5號1.54g）,分別置于10ml離心管中按一定質(zhì)量比加入pH7.5的O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解復(fù)合沉淀物（比例為沉淀/緩沖液=,1/0.8,1/1.6,1/2.0和1/2.4），經(jīng)過3000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘形成不同組成相的PEG/磷酸鹽雙水相體系。1.6鄰苯二酚加氧酶酶活力的測定配置100mg/L苯酚溶液。分別取10ml苯酚溶液+0.5ml酶液（對應(yīng)5組雙水相當(dāng)中的、上相、下相、混合相）。利用液相色譜法分別測定酶解前的苯酚濃度［phe1］，在30C水浴經(jīng)過一小時(shí)后測得酶解后苯酚濃度［phe2］。2結(jié)果2.1苯酚降解菌假單胞菌的活化在經(jīng)過種子培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)后，成功的使菌體活化長出菌落。菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，是類圓形的多邊形。菌落表面潮濕、光滑。（見圖1）圖1：假單胞菌在種子培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24h后形成的菌落2.2PEG6000與酶的共沉及復(fù)溶

經(jīng)過不同緩沖體系的共沉及芙蓉后，鄰苯二酚加氧酶及其他酶成功的在PEG6000與水的雙水相中分離，得到了五種不同的雙水相系統(tǒng)（見圖2）。雙水相萃取穩(wěn)定分層后分離兩相，分別測得上下相的體積比為2：1，1：1，2：3，1：2，1：3（順序?yàn)閺淖蟮接乙惶柟艿轿逄柟埽D2：五種不同的雙水相系統(tǒng)復(fù)溶后酶在兩相中分離情況2.3鄰苯二酚加氧酶酶活力測定結(jié)果根據(jù)測定的結(jié)果，計(jì)算出相應(yīng)的酶活，并計(jì)算出K值和Y值。（見表2）表2：五種不同雙水相體系各相酶活及K值與Y值注：分配系數(shù)K，K=上相酶活力/下相酶活力上相(mg/L)下相(mg/L)混合相（mg/L）各相酶活（u/ml）K值Y下相上相下相混合相口號管[phel]l46.37427144.23427143.73793-1.53354-0.966729.641940.000.00[phe2]l47.l4l04144.71762128.91696二號管[phel]l42.59590143.79263142.785523.54640.586728.2221212.080.14[phe2]l40.82270143.49927138.61446三號管[phel]143.06677142.94801141.828670.18258-2.2436-2.564480.000.00[phe2]142.97548144.06981143.11091四號管[phel]145.32157140.70160143.87504-0.69862-8.3040610.248240.000.00[phe2]145.67088144.85363138.75092五號管[phel]146.60927144.54684143.14679-0.654443.45316-1.726760.000.00[phe2]146.93649142.82026144.01017下相酶的得率Y （%）Y（下相總酶活力/兩相總酶活力）X100=CVX下相 下相 bb100/(CV+CV)=100/(1+KR)(2)aabb式(2)中：C為上相液酶濃度(U/mL),Cb為下相液酶濃度(U/mL),V為上相液體積(mL)aba3討論本實(shí)驗(yàn)以苯酚降解菌假單胞菌成功發(fā)酵產(chǎn)生了所需的鄰苯二酚加氧酶，并結(jié)合雙水相技術(shù)提純了該酶。雙水相萃取技術(shù)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相后，由于被分離物在兩相中分配不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。與傳統(tǒng)溶劑萃取相比，雙水相萃取最大的優(yōu)勢在于雙水相體系可為生物活性物質(zhì)提供一個(gè)溫和的環(huán)境，在萃取過程中保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象，而且雙水相萃取還有收率高、成本低、可連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于生物化學(xué)產(chǎn)品的分離和提取，尤其在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化方面?zhèn)涫荜P(guān)注。分離純化出高純度有生物活性的蛋白質(zhì)向來是一項(xiàng)艱巨的工作。由于蛋白質(zhì)的市場價(jià)格昂貴，如能提高回收率將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，所以有關(guān)蛋白質(zhì)在分離純化中的失活及其對策成為近年來研究的熱點(diǎn)。在蘇玉春[5]等做的實(shí)驗(yàn)中成功比較了不同雙水相體系下的木聚糖酶的酶活，通過比較分離系數(shù)(K)和下相產(chǎn)率(Y)的值得出PEG4000提取效果最好。本實(shí)驗(yàn)使用的PEG6000分別在兩相比例不同的情況下測得K與Y值，結(jié)果只得到當(dāng)上下相體積相等時(shí)可以在兩相及混合相中都測得酶活，而上相為第二管最高，下相為第五管最高，混合相中為第一管最高，可以得出在PEG6000與緩沖溶液比為1/1.6時(shí)，上相中的酶含量最多；當(dāng)PEG6000與緩沖溶液比為1/2.4時(shí)，下相中酶含量最多；當(dāng)PEG6000與緩沖溶液比為1/0.8時(shí)，混合相中酶含量最多。但仍有許多酶活測定為負(fù)值，無實(shí)際意義，即酶活為零。分析可能的原因是因?yàn)樵诎l(fā)酵提取出酶后儲存時(shí)間過長，影響了酶的活力。在吸取樣品上下相測酶活時(shí)，樣品不夠均勻，使得取出的液體中酶含量過少。開展本實(shí)驗(yàn)為研究以雙水相提純生物活性物質(zhì)的方法和條件等奠定了基礎(chǔ)，并為以苯酚降解菌改善環(huán)境提出了新的可能性：以菌產(chǎn)物鄰苯二酚加氧酶直接工業(yè)化生產(chǎn)。參考文獻(xiàn)邊歸國?土壤中苯酚污染治理技術(shù)研究進(jìn)展[J].青海環(huán)境,2007年第三期，第109-112頁馮思琪魏煒袁雅姝張黎微生物降解苯酚的研究進(jìn)展環(huán)