guava easycyte系列操作手冊(cè)

guavaeasyCyte系列為單管上樣系統(tǒng)，由上樣管架、清洗瓶、廢液瓶及頂guavaSoft是一套專為細(xì)胞生物學(xué)研究量身定制的軟件，既提供功能強(qiáng)大，操作靈活的主軟件InCyte，又配置優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的模塊化軟件guavaSuite。在主軟件InCyte中，用戶可根據(jù)自己的研究方向，InCyte內(nèi)置強(qiáng)大統(tǒng)計(jì)學(xué)功能，用戶輕松分析海量數(shù)據(jù)。針對(duì)一些常見實(shí)驗(yàn)，用戶則可以選擇模塊化軟件guavaSuite，軟件中已優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條式設(shè)門、HeatMap直觀展現(xiàn)高通量數(shù)據(jù)信息，更容易實(shí)現(xiàn)多重參數(shù)的IC50/EC50分析功能直接嵌入流式分析軟件，可自動(dòng)計(jì)算IC50/EC50，幫助您更高效地完成實(shí)驗(yàn)。 以通過“開始→程序→Millipore→guavasoft→guavasoft”，打開程序，打開程序后將出現(xiàn)如下界面：上樣管架中可放入 ICF的管子取出，再放入一管裝滿去離子水的樣品管，并上樣。然后點(diǎn)擊“OK”后進(jìn)行清洗。清洗程序完 easyCheckkitsbeadlot#、beadexpirationdate、Expectedparticles/ml（在easyCheckkits中的卡片上面有以上信息，請(qǐng)正確填寫）。按以下流程進(jìn)行easyCheck:easyCheckkits恢復(fù)至室溫，取試劑盒中的小棕色瓶（guavaeasyCheckBeadReagent,2.5ml）beads，充分渦旋振蕩混勻后以透明瓶的稀釋液（guavaCheckDiluent55ml）1:20380ul20ulbeads，然后點(diǎn)擊Start。beads渦旋振蕩混勻，放入上樣管架并上樣，點(diǎn)擊“Run1stReplicate”進(jìn)行第一次數(shù)據(jù)讀?。C(jī)器默認(rèn)讀取1000個(gè)events）。beads后，再次將樣品管進(jìn)行上樣。然后點(diǎn)擊“Run3rdReplicate”進(jìn)行第三次數(shù)5、樣品檢測(cè)（Incyte開放模塊操作為例點(diǎn)擊startnewsessionfile開1可調(diào)用之前adjustsettings，2

將對(duì)照組樣品放到上樣管位置，并OK按鈕，establishingflow

plotFSC-SSCplot用于區(qū)分細(xì)plot（見左圖）plot5調(diào)節(jié)至合適電壓，如調(diào)節(jié)FSC使細(xì)胞群與碎Tips如需準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，請(qǐng)準(zhǔn)備樣本濃度為（8）調(diào)節(jié)電壓使細(xì)胞群處于合適位置后，點(diǎn)擊nextsteps（綠色箭頭將待檢樣品放到上樣管位置，并將樣品管送到ete色箭頭標(biāo)識(shí)），進(jìn)行樣品檢測(cè)。saveandclosecurrentreadyfornextsample時(shí)，檢測(cè)saveandclosecurrentsample按鈕，保存當(dāng)前樣品檢測(cè)信息，即每saveandclosecurrentsample按鈕保存。非常重要：所用樣品檢測(cè)完成之后，點(diǎn)擊stopandclosesessionfile（圖標(biāo)為紅色小手）結(jié)showgroupstats。彈出窗口中顯示添加marker選中要統(tǒng)計(jì)ExporttoCSV導(dǎo)出excel表格格式數(shù)據(jù)。圖片導(dǎo)出：按住ctrl鍵選中需要導(dǎo)出圖片的樣品孔，點(diǎn)擊左上角file-print選擇需要導(dǎo)出的plot，如本次只需勾選P01和P02。

可適用于第三方軟件分析，如FlowJo等。四、guavaeasyCyte系列微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀的日常FlowcellICF沖洗，再用水沖洗，最后用空氣將水排干凈（使用儀器標(biāo)配的注射器），將Flowcell放入專門的儲(chǔ)存盒中；（8-2）Flowcell ICFFlowcellFlowcell在ICF中浸泡過夜。第二天運(yùn)行2次開機(jī)清洗，全程使用去離子水。beads試劑盒。1QuickClean，如果結(jié)果仍出現(xiàn)紅色部分，運(yùn)行一次開機(jī)FSC,SSC,GRN-B,YEL-B,RED-BNIRB,REDR,信息熒光值的10%。1QuickClean，如果結(jié)果仍超出可接受范圍，運(yùn)行一次開counts1002counts低，檢測(cè)器可能出panel顯示檢測(cè)events未達(dá)到設(shè)定數(shù)目1、取下樣本管，換一只含有Bleach1.5mlEP管，點(diǎn)擊2、樣本最小體積為90ul。panel顯示未檢測(cè)到水進(jìn)行QuickClean。前向散射角（C）：在激光照射光束投向細(xì)胞方向的前方收集的信號(hào)，稱為前向散射角（dr）。它與細(xì)胞的橫斷面積、折射率及形狀有關(guān)，一般來說，該值的大90度的位置有另一個(gè)接收細(xì)胞散射的光信號(hào)，稱為側(cè)向散射角（SideScatter）。細(xì)胞表面越粗糙、不規(guī)則或內(nèi)部

Incidentlaser

成正比列關(guān)系

FSC:Forwardanglelightscatter–區(qū)分細(xì)胞與細(xì)胞碎片SSC:Side-angle(90)light

熒光素分子可利用激光提供的能量激發(fā)熒光分子發(fā)光，在發(fā)光的過程中熒光素分子會(huì)吸收激光的能量，在這個(gè)過程中提供能量的激光被稱為激發(fā)光，熒光分子被激發(fā)光激發(fā)后所發(fā)射的熒光被稱為發(fā)射光。熒光素的發(fā)射波長通常比激發(fā)波長更長，這種現(xiàn)象稱為斯托克斯頻移SoesSf）。如熒光；FITC488nm519nm左右發(fā)出綠色PE-Cy5等。這種雙分子熒光素可以分析更多的熒光信號(hào)，為熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量：當(dāng)細(xì)胞所攜帶的熒光素以激光激發(fā)后，發(fā)射的熒光信號(hào)經(jīng)過濾光片分離不同波長的光信號(hào)分別到（iplierub），TDNA胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍，甚至幾萬倍，如采用線性放大，則無法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽性群、陰性群同時(shí)顯示出來，這時(shí)通常就要采用對(duì)數(shù)放大的測(cè)量方式了。在流式細(xì)胞術(shù)中一般前向散射角和側(cè)向散射角多用線性放大，熒光信號(hào)多用對(duì)數(shù)放大。流式細(xì)胞術(shù)中的閾值，是指在測(cè)量時(shí)往往設(shè)定一個(gè)低值，只有大于閾值的信號(hào)才會(huì)被記錄下來。如在前向散射角設(shè)定一個(gè)閾值，即C來排除塵粒、細(xì)胞碎片等低水平噪音信號(hào)的干擾。需要注意的是，閾值一般在檢測(cè)時(shí)根據(jù)圖上的數(shù)據(jù)顯示來調(diào)整，如果閾值設(shè)置太等高線圖（contourplot）：是點(diǎn)圖的另一種表示方式，一張等高線圖可以同時(shí)顯示兩個(gè)熒光通道的數(shù)據(jù)信息，橫縱坐標(biāo)可HeatMap圖對(duì)實(shí)驗(yàn)中的多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較提供了一種以色度進(jìn)行多參數(shù)表示的方法，每一個(gè)分析組參數(shù)在HeatMap圖中都有一個(gè)獨(dú)立的扇形圖來表示。將某種分析方法得到的數(shù)據(jù)或是分析組拖進(jìn)HeaMap圖中，就會(huì)在HeatMp圖中顯示其數(shù)據(jù)或結(jié)果?？着c孔之間的不同深淺的藍(lán)色是根據(jù)結(jié)果的線性比例得到的，顏色的深淺（（陽性結(jié)果，白色表示結(jié)果值最小（陰性結(jié)果））HeatMap圖最6個(gè)分析組參數(shù)的分析結(jié)果。由于熒光素的激發(fā)或發(fā)射波長是正態(tài)或偏態(tài)曲線，即有很寬的范圍，熒光素之間的光譜往往存在交叉或重疊現(xiàn)象（ap）。如C和E的發(fā)射波長之間就有相互重疊的部分，當(dāng)使用這兩種熒光素時(shí)，每一個(gè)熒光素在兩個(gè)檢測(cè)器上都會(huì)有信號(hào)，為了排除這種影響，就需要通過熒光補(bǔ)償?shù)姆椒ㄈコ@部分干擾。設(shè)門是指用門（te）選擇某一或某些特征（熒光性質(zhì)或散射光的性質(zhì)）進(jìn)一步定性或定量分析。設(shè)門是定性細(xì)胞亞群的重要方法。在多熒光參數(shù)、復(fù)雜群體的分析時(shí)，只有通過設(shè)門方法找到各種參數(shù)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，才能對(duì)細(xì)胞有全面的認(rèn)識(shí)。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照進(jìn)行比較，來確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率。完成這一過程的第一步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析，設(shè)門是伴隨數(shù)據(jù)的圖形化分析而產(chǎn)生的。門的形狀可以為任意形狀，如長方形門、矩形門、圓形門、橢圓形門、多邊形門等封閉式圖形門，也可以是線性門或四象限門等開放性的圖形門。每一個(gè)門就是一個(gè)某一區(qū)域的細(xì)胞群，設(shè)門時(shí)可根據(jù)散射光設(shè)門，也可根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門，或是將多個(gè)區(qū)域的細(xì)胞群進(jìn)行組合設(shè)門。定感興趣的細(xì)胞群，分析門內(nèi)細(xì)胞的性質(zhì)，對(duì)門內(nèi)細(xì)胞群進(jìn)行定性和定量分析。設(shè)門是一個(gè)主觀的行為，需要對(duì)所要研究的細(xì)胞有同型對(duì)照就是使用同型抗體進(jìn)行平等實(shí)驗(yàn)，反映待測(cè)標(biāo)本對(duì)抗體非特異性結(jié)合的水平；有些細(xì)胞高表達(dá)Fc受體而待檢測(cè)的為低表FCS（FlowCytometryStandard）是由國際分析細(xì)胞學(xué)會(huì)（InternationalSocietyforAnalyticalCytology，ISAC）制定的一種通用的標(biāo)準(zhǔn)流式分析文件格式，它包含了流式實(shí)驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)集的信息。FCS3.0文件為全部樣品的所有分析數(shù)據(jù)集，F(xiàn)CS2.0則只含有單個(gè)樣品的分析數(shù)據(jù)集。如需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原時(shí)，則需要使用破膜劑以使細(xì)胞膜產(chǎn)生可通透抗體的小孔（俗稱“打孔”），即所謂的破膜過程。破膜的好壞會(huì)直接影響熒光染色的效果和結(jié)果的分析，特別是在細(xì)胞內(nèi)外抗原同時(shí)檢測(cè)時(shí)，尤其重要。在做血液白細(xì)胞分析時(shí)則需要使用紅細(xì)胞裂解液以去除高豐度的紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞分析的影響。GuavaViaCount試劑盒采用雙熒光復(fù)合染料，分別是細(xì)胞入細(xì)胞膜損傷的死細(xì)胞或處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)與核DNA進(jìn)制備單細(xì)胞懸液，用微量移液器輕輕吹打細(xì)胞，以使細(xì)胞充分重懸，再取出GuavaViaCount試劑盒，一般來說比較適合進(jìn)1×105~1×107/ml。根據(jù)不同的細(xì)胞原始濃度應(yīng)采用不同的稀釋倍數(shù)。下表中給出了不同細(xì)胞原始濃 guavaeasyCyte系列儀器，1min左右打開電腦，最后打開guavaSoft軟件。如第一次使用請(qǐng)先運(yùn)easyCyte系列儀器開關(guān)機(jī)操作”的相關(guān)內(nèi)容。在右側(cè)的“AssaySearch”中的下拉菜單中選中“ViaCount”再選擇該欄中右下側(cè)的“Launch”（也可選中后點(diǎn)選“AddtoFavorites”，將該項(xiàng)添加至左側(cè)的“Favorites”中，下次可直接從左側(cè)的“Favorites”中單擊“ViaCount”），進(jìn)入ViaCount模塊。NextStepsettings，見如下小窗口，此步可以點(diǎn)擊savesettings，即可保存當(dāng)前setting，后續(xù)相同實(shí)驗(yàn)可通過RetrieveSettings直接調(diào)用之前保存的Settings。NextStep按鈕之后進(jìn)入樣品檢測(cè)界面后，可在左上角設(shè)置需要檢測(cè)樣品的數(shù)目、名稱及樣品的稀釋比例，設(shè)置完成之后點(diǎn)擊AcquireNextSample，進(jìn)入樣品檢測(cè)過程（圖示為以水作為樣品上樣檢測(cè)時(shí)的截圖，故沒有顯示樣品）。CurrentSample，將當(dāng)前檢測(cè)樣品保存。（-）C的大小進(jìn)行設(shè)置的，只要小于該閾值的都不會(huì)被軟件記錄。在實(shí)際工作時(shí)我們會(huì)讓閾值設(shè)置得小一些以盡量不丟失數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)讀取完畢后可根據(jù)實(shí)際情況對(duì)閾值進(jìn)行調(diào)整以去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片的guaSt0001ctrlApplyCurrentSettingstoSelectedSamples。磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。7-AAD7-AADAnnexin-V7-AAD匹配使用，正常細(xì)胞：AnnexinV(7-AAD早期凋亡細(xì)胞：AnnexinV7-AAD晚期凋亡細(xì)胞：AnnexinV7-AAD合成后期，4C）（M期），DNA4CPI標(biāo)記的方法，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行室溫孵育30min，注意避光。八、guavaeasyCyte系列微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀熒光素(450/45nm)(525/30nm)(512/18(583/26nm)(575/25(620/52nm)(609/30(664/20nm)(695/50nm)7-7-7-FM?5-JC-1R-7-7-PE-JC-1Violetlaser(405R-Bluelaser(488nm)Greenlaser(532nm)&Redlaser(642 ?、?、Incyte開放模塊檢測(cè)細(xì)胞凋亡：guavaeasyCyte6-2L點(diǎn)擊下拉按鈕，可以將incyte和startnewsessionfile,開始樣品檢測(cè)程序（點(diǎn)擊之后，自動(dòng)彈adjustsettings將對(duì)照組樣品放到上樣管位置，并將樣品管送到儀器內(nèi)。點(diǎn)擊K按鈕，調(diào)試sngtyfl結(jié)束之后進(jìn)入電壓調(diào)試程序：具體操作（7-a）選擇需要的plot：其中FSC-SSCplot用于區(qū)分細(xì)胞大小和粒度，為必plot（見左圖）。凋亡散點(diǎn)圖根檢測(cè)細(xì)胞凋亡熒光染料為V-PE7-ADD，根據(jù)其發(fā)射波長，region，調(diào)試電壓時(shí)可省略（7-b）（7-b）FSC-SSCplotnew（7-c）FSC-SSCplotregion拖拽Yellow-Redplot中，建立邏輯（7-d）sampleinfocountgate下P01.R1regionR1中細(xì)胞數(shù)。如設(shè)置檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目為5000P01.R1R1中細(xì)胞數(shù)5000個(gè)，不包含碎片和region外細(xì)胞。（見下頁大圖區(qū)分開，調(diào)節(jié)熒光通道設(shè)置陰性區(qū)間等。Tips如需準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，請(qǐng)準(zhǔn)備樣本濃度為調(diào)節(jié)電壓后，點(diǎn)擊nextsteps（綠色RetrieveSaveAdjust電壓調(diào)節(jié)合適后，可在此步編輯樣品信息e)目（sRetrieveSaveAdjust電壓調(diào)節(jié)合適后，將待檢樣品放到上樣管位置，可直接點(diǎn)擊acquirenextsample按鈕（綠色箭頭標(biāo)識(shí)）。同時(shí)a再次進(jìn)行adjustsettings步驟，調(diào)節(jié)電壓至合csavesettingssettings，以備下saveandclosecurrent左下角顯示readyfornext時(shí)，檢測(cè)一個(gè)樣品完成，點(diǎn)擊andclosecurrentsample按鈕，保將需要檢測(cè)的下一個(gè)樣品放到上樣管位置，并將樣品管送到儀器內(nèi)，點(diǎn)擊acquirenextsample（綠色箭頭），saveandclosecurrent左下角顯示readyfornextsample時(shí)，第二個(gè)樣品檢測(cè)完成，點(diǎn)擊saveandclosecurrentsample按鈕，保存當(dāng)前樣品檢測(cè)信息，即每檢測(cè)完成saveandclosecurrentsample按鈕保存。stopandclosesessionfile（圖檢測(cè)完所有樣品之后，點(diǎn)擊左上角analyse，對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析。同時(shí)也可打開之前fcs文件分析數(shù)據(jù)。mark 點(diǎn)擊newstatmarker添加一個(gè)Quadstatmarker。自動(dòng)彈出下圖顯將所添加的marker調(diào)到合適位置。marker自動(dòng)適用于其他實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)輸出：點(diǎn)擊左側(cè)showgroupstats。彈出窗口中顯示添加marker選中要統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)，點(diǎn)擊右下角ExporttoCSVexcel表格格式（19-a）選擇需要復(fù)制的圖片，點(diǎn)擊右鍵（19-b）圖片導(dǎo)出：按住ctrl鍵選中需要導(dǎo)出圖片的樣品孔，點(diǎn)擊左上角file-printpreview，彈出下頁界面，可對(duì)導(dǎo)出圖片格式進(jìn)保存分析后fcs文件：選中需要保存fcs文件，點(diǎn)擊saveanalysedgroup。將當(dāng)前分析的程序保存。saveanalysed如FlowJo等。?、?、Incyte開放模塊檢測(cè)細(xì)胞周期：guavaeasyCyte6-2L點(diǎn)擊下拉按鈕，可以將incyte和其他程序添加至左側(cè)favorites。startnewsessionfile開始樣品檢測(cè)程序（點(diǎn)擊之后，自動(dòng)彈出下頁顯adjustsettings將對(duì)照組樣品放到上樣管位置，并將樣品管送到儀器內(nèi)。點(diǎn)擊OK按鈕，調(diào)試establishingsteadyflow（7-a）選擇需要的plot：其中FSC-SSCplot用于區(qū)分細(xì)胞大小和粒度，為必plot（見左上圖）Red-Area-HlinRed-Width-Hlin（見region，調(diào)試電壓時(shí)可省略（7-b）（7-b）在FSC-SSCplot中點(diǎn)擊newregion按鈕，添加一個(gè)region（7-c）FSC-SSCplotregion拖拽Red-ARed-Wplot（7-d）在sampleinfocountgate下P01.R1regionR1中細(xì)胞數(shù)。如設(shè)置檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目為5000P01.R1后，為檢測(cè)R15000個(gè)，不包含碎片和region外細(xì)胞。區(qū)分開，調(diào)節(jié)熒光通道設(shè)置陰性區(qū)間等。Tips:如需準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，請(qǐng)準(zhǔn)備樣本濃度為nextsteps（綠色箭頭標(biāo)識(shí)）。之(sampleID)、設(shè)置需要檢測(cè)樣品數(shù)目（eventstoacquire）。RetrieveSaveAdjust電壓調(diào)節(jié)合適后，將待檢樣品放到上RetrieveSaveAdjustadjustsettings步驟，調(diào)節(jié)電壓至合retrievesettings調(diào)用之前已經(jīng)保存的saveandclosecurrent左下角顯示readyfornextsample時(shí)，檢測(cè)一個(gè)樣品完成，點(diǎn)擊saveandclosecurren