應(yīng)用生物化學(xué)-抗體技術(shù)

抗體技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物化學(xué)一.免疫學(xué)知識(shí)

人體和動(dòng)物都有免疫系統(tǒng)，包括非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫主要有宿主的屏障，吞噬細(xì)胞，抗菌物質(zhì)，以及炎癥反應(yīng)。特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。第一節(jié)概述細(xì)胞免疫

主要是指機(jī)體受到異己物質(zhì)（抗原）的刺激后，一類小淋巴細(xì)胞——依賴胸腺的T細(xì)胞發(fā)生增生，分化，直接攻擊靶細(xì)胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。體液免疫

是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細(xì)胞——B淋巴細(xì)胞進(jìn)行增生和分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而合成各種免疫球蛋白(抗體)，然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以被外來的抗原所激活并產(chǎn)生相應(yīng)單一、均勻的特異性抗體，但在體外無法進(jìn)行繁殖和傳代；（短命）

骨髓瘤細(xì)胞在體外具有很強(qiáng)的繁殖能力；（長命）將二者進(jìn)行細(xì)胞融合，制成雜交瘤細(xì)胞，就可以在體外持續(xù)分泌出成分單一的特異抗體，即單克隆抗體。二.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體長命分泌抗體短命分泌抗體長命細(xì)胞融合細(xì)胞融合技術(shù)：1984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第二節(jié)單克隆抗體單克隆抗體是將能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系，而產(chǎn)生的抗體。

由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，所以稱為單克隆抗體。特定目標(biāo)抗原脾臟中B淋巴細(xì)胞刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體一、抗原與動(dòng)物免疫

動(dòng)物免疫B淋巴細(xì)胞大量增殖加強(qiáng)免疫

1.常用的免疫動(dòng)物Balb/c小鼠。

免疫方法常規(guī)免疫法“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”脾內(nèi)一次性免疫法“省時(shí)；省抗原”短程免疫法“省時(shí)”體外免疫法“操作繁瑣”常規(guī)免疫法的免疫途徑

皮下注射腹腔注射靜脈注射第3次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑(皮下注射)第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑(皮下注射)2.常規(guī)免疫法免疫程序：第4次免疫：抗原+不加佐劑(靜脈注射)采集脾臟細(xì)胞二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)1.細(xì)胞融合脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長期制備聚乙二醇（PEG）細(xì)胞融合：濃度40-50%分子量4000,pH8.0,38℃,1min融合方法:

取適量脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞(2×107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r(shí)間控制在1分鐘以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將聚乙二醇融合液緩緩稀釋。脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長期存活不能長期存活2.雜交瘤細(xì)胞的篩選：H：次黃嘌呤;A：氨基喋呤;T：胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)

(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)3.HAT培養(yǎng)基篩選原理4.HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2weekslater1weeklater（每2-3天換液1/2換液）滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)皿要求：簡便、快速、敏感;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)三、抗體的檢測常用方法：抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測技術(shù)原理：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法ELISA法檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。四、克隆化常用克隆化方法：動(dòng)物接種法將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)法利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造

目前制備的單克隆抗體都是鼠源性的，大量應(yīng)用于人體時(shí)可產(chǎn)生人抗鼠抗體，使其作用和效果都受到嚴(yán)重影響，甚至有毒副作用。改造鼠源性單克隆抗體的目的有兩個(gè):一是降低免疫原性，二是降低相對(duì)分子量，增加組織穿透能力。人－鼠嵌合抗體改形抗體ConstantregionVariableregion一、人－鼠嵌合抗體抗體與抗原結(jié)合的功能取決于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。

人－鼠嵌合抗體：鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)基因和人免疫球蛋白的穩(wěn)定區(qū)基因連接起來，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就可表達(dá)出完整的人－鼠嵌合抗體。CDRFRCDR:complementaritydeterminingregionFR:frameworkregion二、改形抗體

用鼠源性單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR）序列替換人免疫球蛋白分子中的互補(bǔ)決定區(qū)序列，則可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。由于抗體分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。最大問題是抗體的親和力下降，甚至喪失活性。三、小分子抗體

基因工程的小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)，其相對(duì)分子量僅為原抗體的1/80到1/3。正在研制：1,Fab片段抗體，由完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)加部分恒定區(qū)；2,Fv抗體，由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成；3，單鏈抗體，由重鏈和輕鏈的可變區(qū)通過一段連接肽連接而成的重組蛋白；4，單域抗體，由重鏈的或輕鏈的單個(gè)可變區(qū)組成；5，最小識(shí)別單位，由互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成。

Fab片段Fv