流感病毒實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)技術(shù)課件

流感病毒實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)技術(shù)佳木斯市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本采集應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)的流感檢測(cè)方案應(yīng)采集鼻拭子和/或咽拭子，和/或依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作來(lái)進(jìn)行采集。對(duì)標(biāo)本采集者應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)。對(duì)于標(biāo)本的處理、儲(chǔ)存和運(yùn)輸應(yīng)遵照流感病毒AH5N1的操作指南來(lái)進(jìn)行。標(biāo)本采集（一）主要采集上呼吸道標(biāo)本鼻咽拭子：將棉簽平行于上顎插入鼻孔，保持幾秒吸收分泌物。口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃體部位，避免觸及舌部；迅速將棉簽放入無(wú)菌、內(nèi)裝3-5ml樣本運(yùn)送液及帶墊圈的螺口塑料管中，在靠近頂端處折斷，旋緊管蓋并密封。氣管分泌液：收集氣管吸取液或支氣管灌溉液5-10ml放入無(wú)菌、帶墊圈的50ml螺口塑料管中，立即密封。標(biāo)本采集（二）血清：采集5-10ml全血放入帶墊圈的螺口管中，不加抗凝劑，待血液凝固分離血清，-20℃保存，血凝塊滅菌處理后棄掉；采集時(shí)間：入院后24小時(shí)；14-28天或出院當(dāng)日。采樣液的要求標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４娌蓸右簯?yīng)包含有一定量的蛋白質(zhì)和抗菌素最佳采樣液：Hank’s液，Eagel’s液,生理鹽水BD15ML采樣管拭子是聚脂纖維桿可折斷，不推薦棉拭和木桿臨床樣本收集的注意事項(xiàng)操作要細(xì)心，嚴(yán)防標(biāo)本間交叉污染，要做好自我保護(hù)采集標(biāo)本要有一定力度標(biāo)本采集后應(yīng)迅速至于冰上或者4℃以下保存，因?yàn)榱鞲胁《緦?duì)熱很敏感標(biāo)本管上寫明：醫(yī)院名稱，標(biāo)本號(hào)，患者姓名，性別，采樣日期標(biāo)本采集后4℃保存，盡量在24小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，未能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的應(yīng)放-70℃或以下保存，放置4℃不應(yīng)超過(guò)4天臨床標(biāo)本運(yùn)輸

臨床標(biāo)本應(yīng)按照A類包裝要求運(yùn)送，并用干冰運(yùn)輸。所有標(biāo)本應(yīng)標(biāo)示清楚。疑似病例標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)包含的信息請(qǐng)參照禽流感標(biāo)本運(yùn)輸。A類感染性物質(zhì)指在運(yùn)輸過(guò)程中與之接觸能對(duì)健康人或動(dòng)物造成永久性殘疾或致命疾病的感染性物質(zhì)。此處“接觸”系指感染性物質(zhì)離開(kāi)保護(hù)性包裝與人或動(dòng)物的身體接觸或經(jīng)呼吸道吸入的情況。A類感染性物質(zhì)使人染病或使人和動(dòng)物都染病者聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，其運(yùn)輸專用名稱為危害人的感染性物質(zhì)；僅使動(dòng)物染病者聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2900，其運(yùn)輸專用名稱為僅危害動(dòng)物的感染性物質(zhì)。

A類感染性物質(zhì)的包裝與標(biāo)簽臨床標(biāo)本的包裝（1）標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡及圈的塑料管里，擰緊。（2）將密閉后的標(biāo)本放入大小適合的塑料袋密封；每袋裝一份標(biāo)本。（3）在采樣管上用油性記號(hào)筆做好標(biāo)記用塑料袋密封。同時(shí)填寫人感染豬流感監(jiān)測(cè)病例標(biāo)本原始登記表，用另一塑料袋密封。（4）將標(biāo)本密封袋放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具有吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一塑料袋內(nèi)再次做密封。所有容器必須有生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)。臨床標(biāo)本運(yùn)送、接收和保存根據(jù)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院424號(hào)令）的有關(guān)規(guī)定，人禽流感標(biāo)本應(yīng)當(dāng)由不少于兩人的專人護(hù)送，并采取相應(yīng)的防護(hù)措施，不得通過(guò)公共電（汽）車和城市鐵路運(yùn)輸。標(biāo)本接受不少于兩人，做好記錄，辦理相關(guān)接受手續(xù)。標(biāo)本保存應(yīng)設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)決策流行早期階段重點(diǎn)在于控制和預(yù)防，此時(shí)高靈敏度的檢測(cè)手段（如流行株特異性核酸檢測(cè)）實(shí)優(yōu)先被選擇的，目的在于發(fā)現(xiàn)起始病例或病例群，以便能夠及時(shí)地進(jìn)行抗病毒治療和制定相應(yīng)的預(yù)防策略。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)決策流感已經(jīng)廣泛流行期間此時(shí)的重點(diǎn)在于臨床病例的確認(rèn)，進(jìn)而防止在醫(yī)院內(nèi)進(jìn)一步傳播擴(kuò)散，因而此時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以采用免疫熒光、快速抗原檢測(cè)（快診）等技術(shù)進(jìn)行病理診斷，并且在有可能的情況下進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。

禽流感(H5N1)病毒的檢測(cè)方法

核酸檢測(cè)抗體檢測(cè)病毒分離抗原檢測(cè)HIMNSRH細(xì)胞分離雞胚分離PCRMDDNASBAIFAELISA膠體金診斷快速；特異度高；靈敏度低；診斷快速；特異度高；靈敏度高；得不到病毒；特異度高；無(wú)法進(jìn)行早期診斷；金標(biāo)準(zhǔn)；病毒可用于其它研究；需要較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法推薦的檢測(cè)方法用Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)豬流行性感冒（H1N1病毒）病毒。檢測(cè)A型流感病毒的M基因、Swine（H1N1）的HA基因和NP基因，以及質(zhì)控對(duì)照RNP基因確診豬流感病毒A/H1N1的唯一可靠的方法是進(jìn)行病毒分離（病毒分離應(yīng)在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行），并且進(jìn)行部分/全基因測(cè)序。其他檢測(cè)方法

快速流感抗原檢測(cè)可以區(qū)分A和B型流感病毒，不能區(qū)分亞型快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)A型流感陽(yáng)性的病例符合可能病例的標(biāo)準(zhǔn)但由于和其它檢測(cè)方法相比靈敏度較低，因此，快速檢測(cè)陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為豬流感感染的最后診斷?？煸\方法的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單快速（＜30min）教過(guò)容易判斷和解釋無(wú)儀器設(shè)備需求，可用于疫情現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)FluA和FluB不能進(jìn)行亞型的鑒別快診的應(yīng)用價(jià)值感染病例的處理：輔助流感病例的臨床治療策略和醫(yī)院處理方案的制定。爆發(fā)疫情的處理：有助于對(duì)爆發(fā)疫情的預(yù)防控制制度的建立。公共健康：在流感爆發(fā)期間，對(duì)于公共場(chǎng)所（如商業(yè)區(qū)、旅游區(qū)）的人群健康，快速診斷將提供有效的信息以供控制方案的制定，提供有效的公共健康建議?？煸\的應(yīng)用價(jià)值監(jiān)測(cè)：為社會(huì)公眾提供流感活動(dòng)情況的“早期預(yù)警”系統(tǒng)。在一些國(guó)家快速檢測(cè)已經(jīng)被應(yīng)用流感的監(jiān)測(cè)形成制度，被用于病毒分離前的標(biāo)本篩選。但是WHO要求對(duì)流感進(jìn)行抗原分析，不推薦把快速檢測(cè)作為監(jiān)測(cè)的單一手段。免疫熒光法免疫熒光試驗(yàn)可以區(qū)分A和B型流感病毒。結(jié)果取決于臨床標(biāo)本的質(zhì)量，操作技能由于免疫熒光和其他免疫檢測(cè)方法中使用的抗體可能不會(huì)和該病毒的靶位點(diǎn)結(jié)合，因此會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果，不能作為豬流感感染的最后診斷。PCR雖然在PCR方法中檢測(cè)流感基因的高度保守片段和確診A型流感的引物也許還可以使用，但目前PCR診斷試驗(yàn)中用于A型流感病毒分型的引物可能不能檢測(cè)非人類病毒。Real-TimePCR基本原理:指在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)RT-PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法.熒光基團(tuán)主要有TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料TaqMan熒光探針工作原理:PCR擴(kuò)增時(shí),在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán).探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),探針被酶切降解,報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接到熒光信號(hào),每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步步驟1.病毒核酸提取:QIAGENRNeasyMiniKit(74104)1.100ul樣品+500ulRLT,混勻靜置5-10分鐘2.加入5UL巰基乙醇和600UL70℅的乙醇充分混勻3將Rnedsyminispin柱子置于干凈的2ML收集管，吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。4吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。5向柱子中加入700ULWashBufferRW1，12000rpm,離心15秒6從Kit中取一支干凈的2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，加入500ulWashBufferRPE（加入44ml無(wú)水乙醇），12000rpm,離心15秒7棄液，加入500ulWashBufferRPE液，13000-14000rpm,離心2分8將柱子移到1.5ml的EP管，加入50ulRnase—freeWater，靜置2分912000rpm,離心1分，收集離心液為提取的RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20℃保存

組分

體積(ul)2xMasterMix12.5x(n+4)上游引物0.5x(n+4)下游引物0.5x(n+4)QuantiTectRTMix0.5x(n+4)probe0.5x(n+4)RNA5.0x(n+4)RNasefreewaterUpto25x(n+4)引物和探針4對(duì)：InfA，swInfA，swH1，RP反應(yīng)體系的配置

實(shí)驗(yàn)步驟反應(yīng)程序

50℃30分