酶工程第五章 酶分子修飾

Chapter5ModificationofEnzymeMolecule酶分子修飾通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程。屬于酶分子工程的一部分。什么是酶分子修飾？

酶分子修飾的意義提高酶的活力

增強酶的穩(wěn)定性

降低或消除酶的抗原性

研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響第一節(jié)金屬離子置換修飾把酶分子中所含的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法。常用的金屬離子Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+適用性本來在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶。一、金屬離子置換修飾的方法（1）加入一定量的EDTA（乙二胺四乙酸）等金屬螯合物到酶液中，與酶分子中的金屬離子螯合；（2）通過透析、超濾、分子篩層析等方法，從酶液中去除EDTA-金屬螯合物；（3）加入另一種金屬離子到酶液中，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合。二、金屬離子置換修飾的作用１、闡明金屬離子對酶催化作用的影響２、提高酶活力鋅型蛋白酶置換成鈣型蛋白酶，酶活力可提高20-30倍；制成晶體，比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。３、增強酶穩(wěn)定性天然含鐵超氧化物歧化酶中鐵原子被錳取代后,酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著改變,重組的含錳酶對H2O2的穩(wěn)定性顯著增強,對NaH3的抑制作用的敏感性顯著降低。４、改變酶動力學(xué)特性?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鈷取代時,酶的底物專一性和最適pH都有改變,鋅酶對N-氯-乙酰丙氨酸的最適pH是8.5,而鈷酶的最適pH是7.0,并且對N-氯-乙酰丙氨酸等三種底物的活力降低，Ｋm增大，親和力降低。第二節(jié)大分子結(jié)合修飾利用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。水溶性大分子：右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物等１、修飾劑的選擇一、大分子結(jié)合修飾的方法大分子在使用前一般需經(jīng)過活化，活化基團才能在一定條件下與酶分子某側(cè)鏈基團反應(yīng)。２、修飾劑的活化

通過修飾提高酶活力酶催化劑能力本質(zhì)上是由其特定的空間結(jié)構(gòu)特別是其活性中心的特定構(gòu)象所決定水溶性大分子通過共價鍵與酶分子結(jié)合后可使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性中心更有利于和底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，使酶活力提高。1分子核糖核酸酶與6.5分子右旋糖酐結(jié)合，活力提高2.25倍。二、大分子結(jié)合修飾的作用增加酶穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性較低是普遍存在的。采用大分子與酶結(jié)合，形成復(fù)合物，就可起到保護(hù)酶的天然構(gòu)象的作用，從而增加酶的穩(wěn)定性。表5-1天然SOD與修飾后SOD在人血漿中的半衰期

酶半衰期天然SOD右旋糖酐-SODFicoll（低分子量）-SODFicoll（高分子量）-SOD聚乙二醇-SOD6min7h14h24h35h降低或消除抗原性抗原能引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)?？贵w當(dāng)外源蛋白非經(jīng)口進(jìn)入人或動物體內(nèi)后，體內(nèi)血清中就可能出現(xiàn)與此外源蛋白特異結(jié)合的物質(zhì)稱之為抗體。當(dāng)酶非經(jīng)口（如注射）進(jìn)入人體后，往往會成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體。當(dāng)這種酶再次注射進(jìn)體內(nèi)時，抗體就會與作為抗原的酶特異地結(jié)合，使酶失去催化功能。用PEG修飾色氨酸酶可完全消除該酶的抗原性。第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈基團修飾采用一定的方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的修飾方法。用于研究酶分子結(jié)構(gòu)與功能：（１）熒光試劑修飾，了解酶水溶液中構(gòu)象；（２）各基團對酶的影響，必需基團；（２）某基團數(shù)量；（４）改變酶性能其側(cè)鏈功能基團有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等，這些基團可組成各種副鍵對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起重要作用。這些功能基團發(fā)生改變，引起副鍵改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而引起酶特性和功能的改變。蛋白酶類的修飾（1）氨基修飾（2）羧基修飾（３）巰基修飾（４）胍基修飾（5）酚基修飾

（６）咪唑基修飾（７）吲哚基修飾（８）分子內(nèi)交聯(lián)修飾側(cè)鏈基團修飾方法三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的氨基修飾劑。反應(yīng)式氨基的化學(xué)修飾

多肽鏈N-末端殘基的化學(xué)修飾：2,4-二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯（DNS）法、苯異硫氰酸酯（PITC）法。碳二亞胺修飾酶的羧基已成為最普遍的方法，條件溫和。反應(yīng)式羧基的化學(xué)修飾+巰基的化學(xué)修飾巰基在維持亞基間相互作用和酶催化過程中起重要作用，具很強的親核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最易反應(yīng)的側(cè)鏈基團。1、烷基化試劑（如碘乙酸等）；2、N-乙基馬來酰亞胺。巰基修飾劑具兩個鄰位羰基的化合物，如丁二酮等，是修飾精氨酸殘基的重要試劑；精氨酸殘基在結(jié)合帶有陰離子底物的酶活性中心部位起重要作用。精氨酸胍基的化學(xué)修飾反應(yīng)式酚基的化學(xué)修飾1、碘化法2、硝化法3、琥珀酰化法酪氨酸殘基上含有酚基，酚基經(jīng)修飾后，引入負(fù)電荷，增加了對正電荷底物的結(jié)合力。修飾方法：分子內(nèi)交聯(lián)劑含兩個反應(yīng)活性部位的雙功能基團，可在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間或其它分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)固。有同型雙功能試劑、異型雙功能試劑。第四節(jié)肽鏈有限水解修飾酶的催化功能主要決定于酶的活性中心構(gòu)象肽段作用（1）在活性中心部位的，起催化作用；（2）在活性中心以外部位，維持酶的空間構(gòu)象。肽鏈被水解后的情況（1）酶活性中心破壞，酶失去催化功能（2）仍可維持酶活性中心的完整構(gòu)象，酶活力保持不變或損失不多（3）有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催化部位，酶催化功能增強或酶活力提高利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

第六節(jié)氨基酸置換修飾將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸置換成另一個氨基酸，從而改變酶的催化特性的修飾方法。

置換的氨基酸催化劑：酪氨酰-tRNA合成酶。其第51位蘇氨酸換成脯氨酸，對ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。例１酪氨酸+tRNA酪氨酰-tRNA酪氨酰-tRNA合成酶１、提高酶活力２、增強酶的穩(wěn)定性。３、酶專一性改變一、氨基酸置換修飾的作用β-干擾素的穩(wěn)定性（修飾后低溫保存半年，活性不變）。干擾素含3個半胱氨酸，其中2個的巰基連成二硫鍵，另一個（Cys-17）游離,易與另一個干擾素的游離巰基結(jié)合失去活性。用絲氨酸置換之,使干擾素不生成二聚體,大大提高其穩(wěn)定性。例2原理二、氨基酸置換修飾的方法1、化學(xué)修飾法２、定點突變法在編碼酶蛋白的基因的特定位點進(jìn)行突變的方法。定位突變是對酶蛋白進(jìn)行有目的改進(jìn)的強有力的方法之一。天然酶基因突變突變蛋白質(zhì)

Sigel等人用定位突變的方法成功地將質(zhì)粒pBR322上編碼β-內(nèi)酰胺酶活性部位的Ser-70的密碼子AGC突變?yōu)榫幋aCys的密碼子TGC。突變的β-內(nèi)酰胺酶分解氨芐青霉素（Amp）的能力大幅下降。第八節(jié)物理修飾通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。特點（1）不改變酶的組成單位和基團；（2）酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變；（3）副鍵發(fā)生某些變化和重排。效果（1）改變底物特異性。多肽酶經(jīng)高壓處理，有利于肽的合成反應(yīng)，降低了水解反應(yīng)的能力（2）提高酶活力，降低最適溫度。高壓處理纖維素酶，30-40OC，酶活提高10%。第九節(jié)酶分子修飾的應(yīng)用一、在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用１、酶的活性中心研究２、酶空間結(jié)構(gòu)研究３、酶作用機制研究（１）親和標(biāo)記法（２）差示標(biāo)記法（３）氨基酸置換法（４）核苷酸置換法二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用１、降低或者消除酶抗原性２、增強醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性三、在工業(yè)方面的應(yīng)用１、提高工業(yè)用酶的活力２、增強工業(yè)用酶的穩(wěn)定性３、改變酶的動力學(xué)特性四、在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用一、抗體酶概述

抗體是和抗原結(jié)合的物質(zhì)。抗體與靶分子精確匹配。產(chǎn)生高度特異性和親和性。免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生108～1010個不同的抗體分子（多樣性）

抗體結(jié)構(gòu)抗體分子是由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。能否利用抗體的這些特性將抗體開發(fā)成象酶那樣的催化劑呢？1969年，Jentcks根據(jù)Panling的化學(xué)反