免疫學(xué)原理與技術(shù)答辯

靶向Del-1蛋白的腫瘤血管阻斷劑與新生血管抑制劑雙效抗體藥物的制備龍益如王慧指導(dǎo)老師答辯人編輯標(biāo)題團(tuán)隊(duì)成員竇俊14404315白華山14404726黃妤璠14404713劉學(xué)成14404818何海龍14404406王敏敏14404729趙雅嬙14404723組長(zhǎng)：龍益如14404806Part1Part2Part3研究思路與方法緒論應(yīng)用前景目錄Contents緒論P(yáng)art1選題背景相關(guān)研究狀況研究意義1.1選題背景Del-1（developmental?endothelial?locus-1）最早被發(fā)現(xiàn)是一種在胚胎血管生成過程中由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ECM蛋白，具有促進(jìn)血管形成的作用，是一種重要的血管再生因子和免疫調(diào)節(jié)因子。四個(gè)觀點(diǎn)惡性腫瘤成為威脅世界人民健康的致命因素針對(duì)腫瘤的預(yù)防、檢測(cè)和治療的研究成為熱點(diǎn)腫瘤微環(huán)境和新生血管是近期藥物研究的熱門靶點(diǎn)Del-1蛋白靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為藥物研發(fā)提供新方向1.1選題背景Del-1蛋白含有三個(gè)重復(fù)表皮生長(zhǎng)因子EGF樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)樣結(jié)構(gòu)域。其第二個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域（EGF2）包含一個(gè)可結(jié)合整合素的重要模體，RGD模體（Arg-Gly-Asp），兩個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)域則可結(jié)合磷脂酰絲氨酸，特殊的結(jié)構(gòu)決定了Del-1在細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮的功能。1.Del-1促腫瘤血管生成作用1.2相關(guān)研究情況結(jié)合αvβ32.Del-1促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移1.2相關(guān)研究情況1.3研究意義學(xué)術(shù)研究意義Del-1作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的胞外基質(zhì)蛋白，抗Del-1蛋白抗體藥物的制備，將為該靶點(diǎn)的實(shí)際應(yīng)用提供相應(yīng)方法，也對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他靶點(diǎn)的研究提供參考。社會(huì)效益可用于治療肝癌、胰腺癌、肺癌、大腸癌等癌癥腫瘤，為惡性腫瘤治療提供新的選擇，幫助病人減輕病痛，提高其生活質(zhì)量。經(jīng)濟(jì)效益制成制備相應(yīng)抗體藥物可用于腫瘤檢測(cè)和治療，將會(huì)有很大經(jīng)濟(jì)效益。010203研究思路與方法Part2理論依據(jù)研究思路可行性說明2.1理論依據(jù)3個(gè)依據(jù)研究的三個(gè)理論依據(jù)理論依據(jù)一理論依據(jù)二理論依據(jù)三Del-1蛋白在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，在正常人組織器官中僅部分部位表達(dá)如眼等。Del-1蛋白在腫瘤新生血管生成、抗腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等多信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。凝血酶原在凝血機(jī)制中起到中心作用，且其轉(zhuǎn)化為凝血酶之后才具有相應(yīng)活性，而凝血酶原和Del-1蛋白在與整合素結(jié)合均依賴RGD模體，可能存在共同抗原。單克隆抗體的制備技術(shù)和小分子抗體制備方法為我們提供了技術(shù)手段。思路ABCDE兵馬未動(dòng)糧草先行切斷運(yùn)糧通道Del-1蛋白靶點(diǎn)抗體導(dǎo)彈親和力、凝血酶原2.2研究思路DEL-1蛋白的3D構(gòu)型2.2.1Del-1相關(guān)情況2.2.1Del-1相關(guān)情況分子量及其特征Del-1蛋白的序列展示2.2.1Del-1相關(guān)情況Del-1蛋白中EGF-2的結(jié)構(gòu)域放大2.2.1Del-1相關(guān)情況實(shí)驗(yàn)所用具體材料2.2.1Del-1相關(guān)情況材料動(dòng)物免疫飼養(yǎng)細(xì)胞的制備瘤細(xì)胞SP2/0的制備免疫脾細(xì)胞的制備細(xì)胞融合陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆細(xì)胞凍存與復(fù)蘇單抗腹水的制備及效價(jià)的測(cè)定1234567982.2.2抗Del-1蛋白的單克隆抗體的制備培養(yǎng)基及血清：胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基；試劑：HT、HAT、PEG3500、CFA、IFA、DMSO；細(xì)胞系：骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0本校實(shí)驗(yàn)室保存；Balb/C小鼠若干；采用鹽析法提純單克隆抗體，對(duì)A-J分別執(zhí)行如下操作，調(diào)節(jié)樣品pH值，加入正辛酸（25ul/l），攪拌30min；室溫高速離心（10000g，30min），收集上清液；再加入硫酸銨（40%飽和度）；4℃高速離心（10000g，15min），棄去上清液；用PBS溶解沉淀，可得到比較純的單克隆抗體A-J溶液。1.單克隆抗體的純化將各株單克隆抗體分別用胃蛋白酶進(jìn)行酶切修飾，然后采取凝膠層析法－用SephadexG-100分離F(ab’)2，具體操作不再贅述；測(cè)定F(ab’)2的分子量、親和力、特異性、效價(jià)等。2.獲取純化的F(ab')2及鑒定2.2.2抗Del-1蛋白的單克隆抗體的制備一、假設(shè)小分子抗體與凝血酶原能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞血管Del-1抗體凝血酶原2.2.3篩選滿足親和力條件的抗體酶免疫技術(shù)法（ELISA）：（1）將單位量Del-1蛋白吸附于固相載體上，洗滌，封阻。（2）用辣根過氧化物酶（HRP）根據(jù)過碘酸鹽氧化交聯(lián)法進(jìn)行抗體標(biāo)記,將酶標(biāo)抗體加入孔內(nèi)。（3）洗滌未反應(yīng)物。（4）加入底物（TMB）。（5）加入濃硫酸終止反應(yīng)，測(cè)OD值，檢測(cè)顯色反應(yīng)的程度，記錄。（6）加入第二種抗體（單位量），重復(fù)前面步驟，直至全部檢測(cè)完。（7）根據(jù)顯色程度大小，將抗體按與Del-1親和力的大小進(jìn)行排序。2.2.3篩選滿足親和力條件的抗體酶免疫技術(shù)法（ELISA）:排序后，按親和力從大到小的順序，同理用ELISA將抗體與凝血酶原反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)親和力，并與上面步驟進(jìn)行比較，直至篩選出滿足“抗體—Del-1親和力大于抗體—凝血酶原親和力”的抗體。篩選滿足親和力條件的抗體2.2.3篩選滿足親和力條件的抗體采用酶切法進(jìn)行酶原修飾，切除酶原無用的基團(tuán)，同時(shí)可減小其分子量，增加穿透性。若所有抗體不滿足2.2.4凝血酶原修飾連接采用流式細(xì)胞儀確定抗原—抗體結(jié)合表位。然后利用基因拼接技術(shù)（基因工程），在融合蛋白作用下，將表位與酶原連接，這樣就可保證抗體與酶原結(jié)合?；蚬こ棠冈梢暈檩d體，篩選得到的抗原表位視為半抗原，用碳化二亞胺法將兩者連接，測(cè)偶聯(lián)比。最后用ELISA找到想要的偶聯(lián)物。蛋白質(zhì)工程當(dāng)抗體不滿足親和力條件時(shí)采用脂質(zhì)體包埋法，將脂質(zhì)體包埋在酶原上，制成多囊顆粒。增加酶原穩(wěn)定性。酶固定化法根據(jù)腫瘤細(xì)胞特有的Warburg反應(yīng)，可將PKM2結(jié)合蛋白結(jié)