噬菌體展示及酵母展示

噬菌體展示技術(shù)

它將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中，從而使表達(dá)的外源肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合而展示在噬菌體表面，被展示的蛋白或肽可以維持相對(duì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性.肽庫(kù)的構(gòu)建噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)是由上億種與噬菌體外殼蛋白以融合的形式呈現(xiàn)在噬菌體表面的多肽所組成，庫(kù)中上億種多肽分別呈現(xiàn)在上億個(gè)噬菌體表面，眾多重組型噬菌體便組成了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)。構(gòu)建肽庫(kù)的關(guān)鍵是獲得足夠的獨(dú)立噬菌體克隆。以6肽為例，至少應(yīng)獲得lo7～109以上的獨(dú)立克隆。根據(jù)噬菌體載體的不同，噬菌體展示系統(tǒng)主要分為：絲狀噬菌體系統(tǒng)、入噬菌體系統(tǒng)、T4噬菌體系統(tǒng)以及．T7噬菌體系統(tǒng)。絲狀噬菌體常以一組隨機(jī)多肽編碼序列或基因群插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫(kù)。在噬菌體展示文庫(kù)的每個(gè)噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈，不同的噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈。絲狀噬菌體屬于單鏈環(huán)狀DNA病毒主要外殼蛋白PVIII和4種次要外殼蛋白PIII、PVI、PIX、PⅦ。PIII與PVIII蛋白一般主要用作展示外源蛋白的錨定蛋白。PIII蛋白位于病毒顆粒的尾端，有3．5個(gè)拷貝，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT3個(gè)功能區(qū)域，其功能是在噬菌體感染大腸桿菌時(shí)與F菌毛結(jié)合，使噬菌體能吸附到細(xì)菌上。PIII蛋白展示系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)是對(duì)外源多肽或蛋白質(zhì)的大小無(wú)嚴(yán)格限制，可用于生物大分子的表達(dá)和功能分析等方面研究。PIII的拷貝數(shù)只有3．5個(gè)，故可用于選擇高親和力的配體，但在免疫學(xué)和生物疫苗研制中受到了限制。PVIII是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2700個(gè)左右PVIII拷貝。由于PVIll分子較小，只能融合較小的外源肽段。但優(yōu)點(diǎn)在于它的拷貝數(shù)多，因此該系統(tǒng)一般用于篩選親和力較低的配體，在疫苗開(kāi)發(fā)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用1噬菌體抗體庫(kù)噬菌體展示技術(shù)被用于產(chǎn)生人、鼠或者其他來(lái)源的重組抗體片段。在構(gòu)建好組合抗體文庫(kù)后，抗原特異的重組抗體片段可以很容易地通過(guò)使用抗原蛋白，表達(dá)抗原的活體細(xì)胞或者是固定的細(xì)胞對(duì)噬菌體文庫(kù)進(jìn)行生物淘選從而將其分離。通過(guò)這一技術(shù)，可以從患傳染病、自身免疫性疾病，以及癌癥患者的骨髓瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞或者外周血細(xì)胞中獲得重組抗體片段?？梢杂糜诓《镜臋z測(cè)和疾病的診斷。構(gòu)建人源性抗體庫(kù)新型疫苗的研究使用噬菌體展示能方便地大量生產(chǎn)疫苗用抗原表位，可以在同一噬菌體上展示多十具有保護(hù)性作用的抗原決定簇，構(gòu)建多價(jià)疫苗。使用病原特異性血清從隨機(jī)肽庫(kù)中篩選出特異性的抗原決定簇，只要它們是疫病特異性的和帶有中和抗原決定簇(B細(xì)胞抗原決定簇或T細(xì)胞抗原決定簇)，都可以用于發(fā)展特異性疫苗。噬菌體展示技術(shù)的局限①隨機(jī)肽庫(kù)容量限制性；②噬菌體文庫(kù)一旦建成，很難進(jìn)行有效的體外突變和重組，從而限制了文庫(kù)中分子遺傳的多樣性；③密碼子的兼并性使噬菌體擴(kuò)增中會(huì)不可避免地造成20種氨基酸合成具有明顯傾傾向性；④大腸桿菌的生物合成系統(tǒng)本身的局限性，不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后修飾；⑤展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否則會(huì)影響噬菌體的裝配與感染。酵母表面展示系統(tǒng)酵母表面展示系統(tǒng)中研究較多的宿主主要是釀酒酵母。①酵母是一種理想的真核生物表達(dá)載體宿主，其基因的表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)的翻譯后加工、分泌機(jī)制比較接近高等真核生物?？梢员磉_(dá)多種不同大小的翻譯后修飾的功能蛋白，用于構(gòu)建蛋白文庫(kù)。對(duì)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，尤其是對(duì)人的蛋白質(zhì)的展示有獨(dú)特的優(yōu)越性；②酵母顆粒大，可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行方便的篩選和分離；③酵母展示的外源蛋白可緊密錨定在細(xì)胞壁上，能耐受SDS的抽提；④酵母遺傳學(xué)操作簡(jiǎn)單，具有發(fā)酵性，生長(zhǎng)快，并且安全無(wú)毒，可用于基因治療及開(kāi)發(fā)口服疫苗等。酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)釀酒酵母的細(xì)胞壁非常堅(jiān)硬，主要由位于細(xì)胞膜外的甘露糖蛋白和β-葡聚糖組成。細(xì)胞壁具有雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層是由β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖連接形成的骨架，外層是主要由甘露糖蛋白組成的纖維狀或毛刷狀的結(jié)構(gòu)。錨定方式作為錨定蛋白的細(xì)胞壁甘露糖蛋白主要存在兩種類型：一種與細(xì)胞壁非共價(jià)松弛連接，可被SDS抽提；另一種與細(xì)胞壁共價(jià)相連，可用β-1，3一或β-1，6葡聚糖酶消化細(xì)胞壁釋放出來(lái)，但不能被SDS（十二烷基硫酸鈉）抽提。共價(jià)連接共價(jià)連接細(xì)胞壁的錨定蛋白根據(jù)其連接方式，可分為GPI型和Pir型。前者的C端都有糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定序列，并通過(guò)β-1，6-葡聚糖連接至β-1，3-葡聚糖，可被β-1，3或β-1，6-葡聚糖酶作用。而后者直接與β-1，3-葡聚糖相連，只可被β-1，3-葡聚糖酶作用，其具體連接方式目前仍沒(méi)有很明確的結(jié)論。GPI型共價(jià)連接細(xì)胞壁的錨定蛋白a凝集素和A凝集素是酵母細(xì)胞壁上的兩種甘露糖蛋白，它們?cè)卺劸平湍傅腶交配型（.MATa）和A交配型（MATA）單倍體細(xì)胞之間介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的性粘附，使細(xì)胞融合形成雙倍體。目前已報(bào)道的酵母表面展示系統(tǒng)有兩種，目的蛋白分別與a或A凝集素融合，展示于酵母細(xì)胞表面。此系統(tǒng)將目的蛋白作為N端，與A凝集素c端部分融合，目的蛋白經(jīng)A凝集素展示于酵母細(xì)胞表面.A凝集素共價(jià)連接到細(xì)胞壁的葡聚糖上其錨定能力由蛋白質(zhì)C端320個(gè)氨基酸組成，富含Ser/Thr殘基.Ser/Thr富集區(qū)因廣泛存在的O-糖基化而擁有一個(gè)桿狀構(gòu)象，可作為空間支撐物發(fā)揮作用.同時(shí)用c-myc（原癌基因）單抗和熒光素偶聯(lián)的dextran(葡聚糖）(FITC-dextran)標(biāo)記的細(xì)胞可用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。絮凝素FlolP富含N-和O糖苷連接而形成桿狀構(gòu)象,在細(xì)胞表面的絮凝反應(yīng)中起著主要作用。Flolp絮凝功能結(jié)構(gòu)域靠近N端，識(shí)別細(xì)胞壁中的A甘露聚糖組分并與之非共價(jià)結(jié)合，引起細(xì)胞聚集成可逆性絮狀物。兩種類型的絮凝素展示系統(tǒng)1.GPI系統(tǒng)包括8種由Flolp的C端構(gòu)建的含有GPI錨的細(xì)胞表而展示系統(tǒng)，根據(jù)目的蛋白的特性確定FlolP肽段的長(zhǎng)度，然后將目的蛋白的C端與錨定序列融合.2是利用FIolP的絮凝結(jié)構(gòu)域的黏附能力創(chuàng)建一