修飾的TACAs作為腫瘤疫苗抗原

修飾的TACAs作為腫瘤疫苗摘要：本文簡述腫瘤相關(guān)性糖抗原(Tumor-associatedcarbohydrateantigens,TACAs)及TACAs作為腫瘤疫苗的種類，并介紹了修飾的TACAs作為腫瘤疫苗研究現(xiàn)狀及被動治療和主動治療策略。關(guān)鍵詞：TACAs腫瘤疫苗被動治療主動治療細(xì)胞中廣泛存在糖基化修飾現(xiàn)象［1］，細(xì)胞外的單糖，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖等進(jìn)入細(xì)胞后，首先被合成核苷酸-單糖作為糖基化的糖供體，在定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等一系列酶的作用下，糖基與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合，形成糖蛋白和糖脂，參與細(xì)胞的生命活動［1］。細(xì)胞表面的寡糖在細(xì)胞識別、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用。從20世紀(jì)70年代以來，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面寡糖鏈結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變有關(guān)，因此稱其為腫瘤相關(guān)性糖抗原(TACAs)27］。目前，越來越多的TACAs被關(guān)注，研究者將TACAs分為四類㈤，它們分別是神經(jīng)節(jié)苷脂類、Mucin相關(guān)抗原、Lewis抗原和Glob?？乖ａ槍ACAs抗原的疫苗研發(fā)已經(jīng)廣泛地開展［9］。研究者開發(fā)了天然的TACAs疫苗。研究者將GM2抗原、GM2抗原和BCG佐劑混合物免疫小鼠和腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)沒有抗體產(chǎn)生或只能產(chǎn)生IgM，說明天然TACAs作為腫瘤疫苗還面臨一些問題，主要表現(xiàn)在㈤：1.許多腫瘤相關(guān)抗原在一些正常細(xì)胞中出現(xiàn)，因此導(dǎo)致天然TACAs免疫原性低或自抗原。2.腫瘤細(xì)胞表面寡糖鏈具有微不均一性。3.大多數(shù)糖鏈?zhǔn)荁細(xì)胞抗原，不能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。針對上述問題，研究者開展了一系列的研究。首先，TACAs必須純化并確定其結(jié)構(gòu)。其次，為了解決TACAs微不均一性問題，需要將多種TACAs結(jié)合或者混合，才能使腫瘤疫苗包含多種TACAs。最后，為了誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，需要將TACAs連接至已知免疫原性載體上，以增強(qiáng)免疫原性，如蛋白質(zhì)和佐劑等。目前，研究者已開發(fā)出半合成和全合成疫苗來增加免疫原性凹，雖然目前有多種TACAs疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但是還沒有一種疫苗上市。因此，研究者以修飾的TACAs，結(jié)合糖基工程修飾腫瘤細(xì)胞表面的寡糖鏈，開發(fā)出一種新的TACAs腫瘤疫苗。1.修飾的TACAs作為腫瘤疫苗的被動治療。修飾的TACAs作為腫瘤疫苗的策略主要有兩種方式［1。］，一是被動治療，一是主動治療。被動治療的過程是，首先以糖基工程策略改造病人腫瘤細(xì)胞表面TACAs,使其表面帶有修飾的TACAs,同時(shí)以合成的修飾TACAs與免疫增強(qiáng)劑結(jié)合，制備單抗，然后以單抗治療病人。Zou.etal.以合成的GD3及系列衍生物，與免疫增強(qiáng)載體KLH結(jié)合，制備疫苗，結(jié)合糖基工程修飾的黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-28表面GD3，在體內(nèi)和體外評價(jià)該系列疫苗的治療效果［11。研究者首先合成丙?；⒍□；捅郊柞D3-KLH結(jié)合物，免疫小鼠并檢測抗體滴度。結(jié)果顯示，在系列GD3衍生物-KLH中，丁酰GD3-KLH結(jié)合物的免疫原性最高。其次，黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-28體外培養(yǎng)，并以糖基工程改造其表面的GD3。該細(xì)胞系通過分別與1，3，5mg/ml的乙酰基、丙?；?、丁酰基和苯甲酰GD3孵育，1-3，6，10天后取細(xì)胞用FACS檢測，結(jié)果顯示，1mg/ml修飾的Man孵育1天就能顯著增加腫瘤細(xì)胞表面修飾的GD3,增加濃度或時(shí)間均不能顯著增加修飾的GD3表達(dá)。第三，特異性檢測。以丙?；?、丁酰基和苯甲酰GD3-KLH結(jié)合物免疫血清，分別與丁酰基GD3-SK-MEL-28孵育，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示，只有丁?；鵊D3-KLH免疫血清能與丁酰基GD3-SK-MEL-28細(xì)胞結(jié)合；以丁酰基GD3-KLH免疫小鼠，制備單抗2A（IgG2a）和單抗1（IgG1），再以單抗分別與乙?；⒈；⒍□；捅郊柞D3-SK-MEL-28孵育，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示單抗2A和單抗1與丁酰GD3-SK-MEL-28結(jié)合最好，與丙酰酰GD3-SK-MEL-28有一定的交叉反應(yīng)，上述結(jié)果說明丁酰基修飾的GD3-KLH免疫產(chǎn)物特異性地識別表達(dá)丁?；揎桮D3的細(xì)胞。第四，體外抗腫瘤活性的檢測。以丁?；鵊D3-KLH免疫血清和單抗2A檢測抗腫瘤活性，補(bǔ)體殺傷實(shí)驗(yàn)（CDC）結(jié)果顯示，丁酰基GD3-KLH免疫血清和單抗2A均對丁?；鵊D3-SK-MEL-28細(xì)胞有殺傷作用。第五，腫瘤細(xì)胞表面修飾的GD3體內(nèi)表達(dá)。建立腫瘤細(xì)胞動物模型，在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)修飾的GD3。研究者以裸鼠建立SK-MEL-28腫瘤模型，然后腹腔注射丁?；事短牵欢〞r(shí)間后，將腫瘤細(xì)胞取出，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示，體內(nèi)SK-MEL-28細(xì)胞表面表達(dá)了丁酰基GD3。第六，體內(nèi)抗腫瘤效果檢測。在裸鼠腫瘤模型中，以丁?；事短翘幚砗?，再以單抗2A處理，結(jié)果顯示，單抗2A處理期間，顯著抑制腫瘤生長，但停止單抗處理后，腫瘤則快速生長，說明修飾的TACAs結(jié)合糖基工程修飾的腫瘤細(xì)胞在一定程度上可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。2.修飾的TACAs作為腫瘤疫苗的主動治療。被動治療在一定程度上抑制腫瘤的生長，但是也有一些缺陷，主要是單抗制備周期長，并價(jià)格昂貴。鑒于此，GuoZetal3］提出了主動治療策略，該策略與被動治療的區(qū)別在于，治療腫瘤細(xì)胞的抗體不是外源的，而是由病人自己產(chǎn)生。簡言之，首先為病人免疫修飾的TACAs疫苗，激發(fā)病人自身產(chǎn)生抗體，然后以糖基工程策略改造病人腫瘤細(xì)胞，使其表面帶有修飾的TACAs，以病人自身產(chǎn)生抗體治療腫瘤。Pan.etal.3］合成GM3系列衍生物，包括N-丙?；-丁?；-異丁?；蚇-苯乙酰修飾的GM3，該系列衍生物與KLH結(jié)合，結(jié)合物分別免疫6只C57小鼠，檢測抗體滴度。結(jié)果顯示，修飾的GM3-KLH免疫血清均比未修飾的GM3-KLH免疫血清抗體滴度高。然后檢測了系列GM3-KLH結(jié)合物免疫抗體的亞型滴度，結(jié)果顯示在系列GM3衍生物-KLH結(jié)合物中，苯乙酰GM3-KLH免疫血清中的抗體含量最高，其IgG1/IgG2a/IgG3的含量均最高。其次，檢測系列GM3衍生物-KLH結(jié)合物免疫血清與未修飾的GM3交叉反應(yīng)活性，結(jié)果顯示，苯乙酰GM3-KLH免疫血清與未修飾的GM3沒有交叉反應(yīng)，特異性較好。由于苯乙?；鵊M3-KLH結(jié)合物免疫原性較好，因此Chefalo.etal.開展了在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)苯乙?；鵊M3的研究。結(jié)果顯示，相對于N-丙?；-丁?；蚇-異丁酰基修飾的GM3未在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)或表達(dá)量非常低，苯乙酰基GM3在腫瘤細(xì)胞系SKMEL-28、K562和B16-F0細(xì)胞表面大量表達(dá)，并具有體外抗腫瘤活性［10］。由于苯乙酰基修飾的GM3-KLH結(jié)合物在體外具有抗腫瘤活性，Qiu.etal.開展了苯乙酰基修飾的GM3作為腫瘤疫苗在體內(nèi)抗腫瘤活性的研究。首先以鼠源的黑色素瘤細(xì)胞系B16F0在C57小鼠中建立腫瘤動物模型，然后在該模型的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)苯乙?；揎椀腉M3。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)了大量的苯乙酰基修飾的GM3，而正常組織細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)苯乙?；揎椀腉M3，說明糖基工程改造病人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞表面TACAs是安全的。體內(nèi)抗腫瘤活性分析表明，以苯乙酰基修飾的GM3-KLH結(jié)合物免疫小鼠，結(jié)合糖基工程改造小鼠腫瘤細(xì)胞表面TACAs可以顯著降低腫瘤生長速度并顯著延長腫瘤小鼠壽命［13］。上述結(jié)果說明修飾的TACAs作為腫瘤疫苗主動療法的有效性。由于修飾的TACAs作為腫瘤疫苗取得了一定的效果，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。基于交叉反應(yīng)腫瘤糖疫苗［14］和LipidA作為免疫增強(qiáng)載體［15］也展現(xiàn)了很好的前景，說明治療性抗腫瘤糖疫苗的具有非常廣闊的發(fā)展空間。參考文獻(xiàn)BertozziCR,KiesslingLL.Chemicalglycobiology[J].Science.2001,291(5512):2357-2364.HakomoriS.Tumor-associatedcarbohydrateantigensdefiningtumormalignancy:basisfordevelopmentofanti-cancervaccines[J].AdvExpMedBiol.2001,491:369-402.ChapmanPB,MorrisseyDM,PanageasKS,etal.InductionofantibodiesagainstGM2gangliosidebyimmunizingmelanomapatientsusingGM2-keyholelimpethemocyanin+QS21vaccine:adose-responsestudy[J].ClinCancerRes.2000,6(3):874-879.RagupathiG.Carbohydrateantigensastargetsforactivespecificimmunotherapy[J].CancerImmunolImmunother.1996,43(3):152-157.OtteniJC,SteibA,PottecherT.[Cardiacarrestduringanesthesiaandrecoveryperiod][J].AnnFrAnesthReanim.1990,9(3):195-203.LivingstonPO,RitterG,CalvesMJ.AntibodyresponseafterimmunizationwiththegangliosidesGM1,GM2,GM3,GD2andGD3inthemouse[J].CancerImmunolImmunother.1989,29(3):179-184.HakomoriS.Aberrantglycosylationincancercellmembranesasfocusedonglycolipids:overviewandperspectives[J].CancerRes.1985,45(6):240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