酵母雙雜相關(guān)步驟

YPD:Difcopeptone20g/LYeastextract10g/L葡萄糖YPD固體:20g/LDifcopeptone20g/LYeastextract10g/L葡萄糖20g/LDifcoAgar(forplatesonly)20g/L調(diào)pH至6.5,滅菌條件為高壓1210C滅15min(以下所涉及的需要加入碳源的培養(yǎng)基類型均與此相同)。YPDA：YPD冷卻至55oC，添加5mL/L0.6%Ade。每升加YMB酵母無氨基氮源6?7g(威佳)，-leu氨基酸(takara),無水葡萄糖20g,瓊脂20g,pH5?8SMARTIIIOligo(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3')CDSIIIPrimer(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3')*5'PCRPrimer(5'-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3')3'PCRPrimer(5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3')AD5'CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCAD3'GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT一、利用CDSIII引物合成單鏈cDNA滅菌離心管加1-2ul RNA(0.025-1.0ug的mRNA)1.0ulCDSIII引物加入滅菌去離子超純水至總體積為4.0ul.混勻3.72°C水浴2分鐘

4.冰水中冷卻2分鐘5.輕微離心6.加入一下試劑2.0ul5XFirst-StrandBuffer1.0ulDTT(20mM)1.0uldNTP(10mM)1.0ulMMLV反轉(zhuǎn)錄酶7.混勻42°C水浴10分鐘加入1.0ul的BDSMARTIII寡核苷酸42C水浴1小時(shí)（加石臘油）擴(kuò)增儀上75C放置10分鐘，終止合成反應(yīng)冷卻至室溫，加入2.0ul（2.0單位）的RNaseH.1337C溫浴20分鐘。14.-20C條件下放置備用。四、用LD-PCR擴(kuò)增單鏈CdnaPCR擴(kuò)增儀預(yù)熱至95C在離心管加入如下藥品2.0ul 單鏈cDNA70ul 去離子超純水10ul10XBDAdvantage2PCR緩沖液2ul 50XdNTPMix2ul 5'PCR引物2ul 3'PCR引物10ul 10XGC-Melt溶液2ul 50XBDAdvantage2聚合酶混合液小心混勻，輕微離心加2滴滅菌石蠟油擴(kuò)增程序95C3095C30secN個(gè)循環(huán):95°C10sec68°C6min（注意：每個(gè)循環(huán)過后，退火時(shí)間增加5秒68C 5min取7ul擴(kuò)增產(chǎn)物，加Marker，在1.2%的瓊脂糖膠電泳，與附錄A中圖譜對(duì)照，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。—20C條件下放置備用。五.用BDCHROMASPINTE-400濾柱純化回收雙鏈cDNA取出濾柱，上下晃動(dòng)幾次，每95ul樣品用一個(gè)濾柱用食指和拇指夾出濾柱活動(dòng)管子，把濾柱套入收集管，保存好兩端帽子備用。3.700Xg離心5分鐘。取下濾柱，丟棄收集管和濾液。濾柱重新套入另一2ml的收集管，小心的把95ul的cDNA樣加到濾柱膠面中央，以免樣品從膠面的內(nèi)側(cè)流出。700Xg離心5分鐘。7?取下濾柱和收集管，純化了的cDNA集中在收集管的底部。來自同一樣品，純化了的cDNA放入統(tǒng)一離心管。加入如下試劑：1/10體積乙酸鈉（3M;PH4.8）2.5體積95%乙醇（一20°C）輕微搖勻—20C條件下過夜。室溫下，14000rpm離心20分鐘。小心吸出上清液輕微離心使余液全都集中到離心管底部。小心吸出余液，cDNA小團(tuán)塊在空氣中干燥10分鐘。用20ul的去離子超純水溶解cDNA小團(tuán)塊，一20°C條件下放置備用。cDNA文庫的建立-YPD培養(yǎng)基加入25%甘油?準(zhǔn)備PEG/LiAc溶液(參考III部分)lXPEG/LiAcsol:8ml50%PEG,1ml10xTE,1mllOxLiAc,l.lXTE/LiAc:l.lml10xLiAc,1.1ml10xTE,7.8mlH^)(water)1．酵母感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備在YPDA培養(yǎng)基上接種酵母AH109菌株，培養(yǎng)時(shí)間W4周，菌落直徑為2—3mm15ml滅菌離心管加3ml的YPDA液體培養(yǎng)基，每管一個(gè)菌落，30°C,250rpm,8h吸取5卩l(xiāng)種子液加入到含有50mlYPDA的250ml三角瓶中30C，250rpm，16~20h測(cè)OD600=0.15?0.3，將培養(yǎng)液移至50ml離心管室溫，700rcf,5min，棄上清液用100mlYPDA重懸沉淀，用500ml三角瓶搖，30C，250rpm，3~5h測(cè)OD600=0.4?0.5，將培養(yǎng)液分裝到兩個(gè)50ml離心管，室溫，700rcf，5min，棄上清液每管加入30ml去離子超純水，重懸沉淀，700rcf，5min,去上清用3ml1.1*TE/LiAc懸浮菌體，吸出與兩支1.5ml離心管，12,000rpm15~30s棄去上清液，每管加入600Ul1.1*TE/LiAc重懸沉淀，備用Caution：制出的感受態(tài)必須馬上使用以下是轉(zhuǎn)化過程16.在一個(gè)15ml的離心管里加入如下藥品20uldscDNA6ulpGADT7-Rec(0.54ug/ul)20ulHerringTestesCarrierDNA(已變性)(HerringTestesCarrierDNA的變性：離心管加入約50ul的HerringDNA,100C條件下變性5分鐘，迅速在冰水中冷卻。加入15ml的離心管前要再重復(fù)變性冷卻一次)在DNA中加入600ul的感受態(tài)酵母細(xì)胞18．輕輕搖勻加入2.5ml的PEG/LiAc溶液輕輕搖勻30°C條件下溫浴45min,每15分鐘混勻一次）加入160ulDMSO,搖勻，42C條件水浴20分鐘，每10分鐘搖勻一次700Xg離心5分鐘去掉上清夜，每個(gè)管加入3ml的YPDPlus液體培養(yǎng)基（注意：不能用標(biāo)準(zhǔn)的YPD培養(yǎng)基）30C搖菌90分鐘。700Xg離心5分鐘去掉上清夜，加入15ml0.9%的NaCl溶液。在SD/-Leu培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化株在準(zhǔn)備好的150mm含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂抹150ul的菌液（約需100個(gè)）（在100mmSD/-Leu含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上分別涂抹1：10，1：100，1：1000，和1：10000稀釋了的菌液，以檢測(cè)轉(zhuǎn)化的效率）培養(yǎng)皿倒置，在30C條件下培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)，（一般要培養(yǎng)3—6天）計(jì)算轉(zhuǎn)化效率：一般要求三1X106轉(zhuǎn)化株/3ugpGADT7-Rec轉(zhuǎn)化株收集培養(yǎng)皿在4C條件下保存3—4個(gè)小時(shí)32.每個(gè)培養(yǎng)皿加入5ml冷卻的培養(yǎng)基用滅菌的玻璃珠輕輕滾動(dòng)，把酵母細(xì)胞驅(qū)進(jìn)液體把所有的液體導(dǎo)入一個(gè)滅菌了的三角瓶里并混勻用血球計(jì)檢測(cè)濃度。如果濃度＜2X107個(gè)細(xì)胞/ml,可通過離心減少懸濁液的體積按1ml/管的量分裝，在一80C條件下保存?zhèn)溆谩＃ū４鏁r(shí)間不能超過1年）在100mmSD/-Leu含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上分別涂抹按1：100，1：1000，和1：10000稀比例釋了的菌液100ul,30C條件下培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)（一般要培養(yǎng)2—3天），數(shù)菌落數(shù),估計(jì)文庫的滴度濃度。酵母質(zhì)粒抽提按照天根公司提供說明書進(jìn)行。⑴取一個(gè)新長(zhǎng)的((2-4天)直徑在2-4毫米的菌落，放入3.ml相應(yīng)的SD液體培養(yǎng)基。使勁搖晃，使菌落散開，變成渾濁液，在30°C條件下，以230一250的速度搖菌過夜。⑵14000rpm離心5min,使細(xì)胞沉淀，盡量吸除上清液。(3)向菌體沉淀中加入100u1山梨醇BUFFER，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮酵母細(xì)胞沉淀。⑷向細(xì)胞懸液中加入50ULyticase溶液，30C放置30-60mins。(5)6500rpm(4,000Xg)離心5min,吸除上清，保留沉淀。⑹用250u1YP1溶液(使用前加入RNase)重懸沉淀，徹底懸浮菌體。(7)向管中加入250u1YP2溶液，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。⑻向管中加入350u1YP3溶液，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10mins(同時(shí)預(yù)處理吸附柱CB2:向吸附柱中加入500u1的平衡液BL,13,000rpm離心lmin,倒掉收集管巾的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑼小心地將上清液加入吸附柱CB2,13,000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱CB2中加入500u1去蛋白液PD,13,000rpm離心30sec，倒掉廢液。向吸附柱CB2中加入700u1漂洗液PW(使用前加入酒精),13,000rpm離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液。向吸附柱CB2中加入700u1漂洗液PW(使用前加入酒精),13,000rpm離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱CB2重新放回收集管中，13,000rpm離心2min，去除吸附柱中殘余的漂洗液，再將吸附柱CB2置于室溫或500C溫箱放置數(shù)分鐘，充分去除吸附柱中殘余的漂洗液。吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間不為懸空滴加50-100u1經(jīng)65-70C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB,室溫放置2min.13,000rpm離心lmin,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。為了提高質(zhì)粒的回收效率，可將得到的質(zhì)粒溶液重新加入吸附柱中，重復(fù)步驟(14)。利用LD-InsertScreeningAmplimer檢測(cè)克隆質(zhì)粒插入片段檢測(cè)引物序列:AD5'Primer.5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3'.AD3'Primer.5'-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT-3'.

在0.5ml耐的滅菌離心管加入如下藥品:PCR-grade去離子水38.6ull0xPCRbuffer5ulAD5'Primer.(lOuM)1u1AD3'Primer(lOuM)1u1dNTPMix(2.SmMea.)4u1rTaq(SU/ul,Takara)總體積50u10.4u1用火菌的槍尖，從要分析的菌落中挑出一些細(xì)胞，加入含有反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管。擴(kuò)增條件:95°C3min先變性后，進(jìn)行95°C30s,68°C3min二溫度PCR反應(yīng)，共30個(gè)循環(huán):最后一循環(huán)68C5min.取10ul產(chǎn)物，在1.2%的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)結(jié)果。TheProtocolsforYeastTwo-hybridScreening酵母感受態(tài)的制備準(zhǔn)備的物品：YPDA，SD/-Trp平板與液體培養(yǎng)基，滅菌12ml搖菌管2~3個(gè)，滅菌大小槍頭，滅菌50ml離心管6~8個(gè)，250ml三角瓶2~3個(gè)，500ml三角瓶1~2個(gè)，滅菌涂棒,滅菌1.5ml離心管，滅菌去離子超純水Protocol：挑取2~3個(gè)AH109或Y187單克隆，接種于3mlYPDA液體培養(yǎng)基，30C，250rpm，8h吸取5卩l(xiāng)種子液加入到含有50mlYPDA的250ml三角瓶中I30C，250rpm，16~20h測(cè)OD600=0.15?0.3，將培養(yǎng)液移至50ml離心管室溫，700rcf,5min，棄上清液用100mlYPDA重懸沉淀，用500ml三角瓶搖，30C，250rpm，3~5h測(cè)OD600=0.4?0.5，將培養(yǎng)液分裝到兩個(gè)50ml離心管，室溫，700rcf,5min,棄上清液每管加入30ml去離子超純水，重懸沉淀，700rcf,5min,去上清用3mll.l*TE/LiAc懸浮菌體，吸出與兩支1.5ml離心管，12,000rpm15?30s棄去上清液，每管加入600ul1.1*TE/LiAc重懸沉淀，備用Caution：制出的感受態(tài)必須馬上使用誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)：Protocol：r100ng質(zhì)粒DNA在1.5ml預(yù)冷的離心管中加入、3ul變性的herringcarrierDNA50ul酵母感受態(tài)（Caution:剛剛制好）輕輕混勻，加入500ulPEG/LiAc溶液J30°C熱板放置30min,每10min輕輕搖勻一次加入20ulDMSO混勻（Caution：一定緩慢）I42C熱板熱擊15min,每5min緩慢搖勻一次（Caution:—定緩慢）I冰上放置1?2min12,000rpm,15~30s，棄上清!加入1ml生理鹽水（0.9%NaCl）涂SD/-Trp板30°C培養(yǎng)2?3dHerringcarrierDNA變性方法：100C熱板變性10min,冰上冰凍10min,如此重復(fù)一次,冰上備用誘餌載體毒性與自激活檢測(cè)：Protocol：將挑取2~3個(gè)單克隆，用3ml-Trp液體培養(yǎng)基30C,250rpm培養(yǎng)，可搖起無毒性取2ml菌液于1.5ml離心管,剩下的菌液保存菌液12,000rpm,15?30s，棄上清將離心管在液氮中速凍10min,取出使其自然溶解10min,重復(fù)一次加入50ulZ/X-ga1溶液（Caution：現(xiàn)配現(xiàn)用），30C溫育24h,無染色為無自激活誘餌載體與文庫雙雜交：要準(zhǔn)備的物品：1*YPDA，2*YPDA，0.5*YPDA，SD/-Trp液體培養(yǎng)基，四缺平板，滅菌的12ml搖菌管，滅菌的50ml離心管，滅菌1~2個(gè)500ml三角瓶，滅菌2L三角瓶，滅菌槍頭,滅菌涂棒Protocol：于早上9：00挑取2~3個(gè)誘餌載體單克隆于3ml1*YPDA,30C,250rpm,12h21：00將其中1管所有菌液倒入裝有200mlSD/-Trp的500ml三角瓶中，30C,250rpm,12h次日早上9：00前，測(cè)OD600,當(dāng)OD600=0.6?0.8時(shí)停止分裝到4支50ml離心管中，室溫，1,000rcf,10min,棄上清用5ml1*YPDA懸浮菌體|5ml懸浮菌液在21三角瓶中加入」mlcDNA文庫菌種45ml2*YPDA（50ug/m1,實(shí)驗(yàn)室母液2/1000vKanr）30°C,30~50rpm,20~24h，停止雜交，取培養(yǎng)液于50ml離心管再用50ml0.5*YPDA（50ug/m1,實(shí)驗(yàn)室母液2/1000vKanr）沖洗雜交瓶，將殘余的菌液沖洗出來,裝入另一支離心管J室溫，1,OOOrcf,10min用10ml生理鹽水懸浮菌體，混勻后以100ul/小板，300ul/大板涂板I30C培養(yǎng)培養(yǎng)3d后，會(huì)有克隆長(zhǎng)出，這些為強(qiáng)互作的克隆，將其轉(zhuǎn)移到新的四缺板上，在6d前會(huì)有大概200個(gè)