多肽類(lèi)藥物長(zhǎng)效化技術(shù)的研究進(jìn)展

多肽類(lèi)藥物長(zhǎng)效化技術(shù)的研究進(jìn)展

近年來(lái)，作為引起國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)術(shù)界關(guān)注的課題，多媒體藥物已被廣泛用于癌癥、艾滋病和其他疾病的治療。多肽類(lèi)藥物雖然安全、生物活性好,但多數(shù)因半衰期較短而需頻繁給藥,這使病人的依從性大大降低,并且治療費(fèi)用也較大,因此,為了保持藥效的持久、不用頻繁給藥,對(duì)于長(zhǎng)效多肽類(lèi)藥物的研發(fā)近年來(lái)成為了多肽藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。多肽類(lèi)藥物的長(zhǎng)效化技術(shù)主要有體外化學(xué)修飾技術(shù)、生物技術(shù)和緩控釋制劑技術(shù)。體外化學(xué)修飾技術(shù)是在多肽水平上,使用合適的修飾方法和修飾劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾,使修飾后的多肽類(lèi)藥物在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。該技術(shù)主要包括主鏈末端的修飾、側(cè)鏈的修飾、環(huán)化、氨基酸替換、糖基化修飾及PEG修飾等。1c端酰胺化及糖基化化合物多肽類(lèi)藥物常用的主鏈末端修飾方法是N端的乙?；饔煤虲端的酰胺化作用,分別對(duì)肽鏈兩端氨基和羧基進(jìn)行保護(hù),使多肽不會(huì)很快地被相應(yīng)的多肽蛋白酶降解。目前這一技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多肽的化學(xué)合成中。N端乙酰化通常是在固相合成多肽反應(yīng)的整個(gè)肽鏈組合完畢后,加入乙酸酐使其乙?；端的酰胺化則是通過(guò)選擇裂解產(chǎn)物為酰胺的樹(shù)脂或者選擇不同裂解方式來(lái)完成。Brinckerhoff等通過(guò)對(duì)具有免疫原性的多肽MART-I27-35進(jìn)行N端的乙酰化或者C端的酰胺化,明顯提高了該多肽在血漿中的穩(wěn)定性。主鏈末端連接不同長(zhǎng)度的脂肪酸、主鏈C端或N端的PEG修飾及糖基化修飾,其基本原理都是增加多肽分子的相對(duì)分子量和空間位阻,提高其對(duì)多肽水解酶的穩(wěn)定性,減少腎小球的濾過(guò)作用。RC-160是一種具有抗增生活性的生長(zhǎng)激素抑制劑類(lèi)似物。Dasgupta等將各種長(zhǎng)度的脂肪酸連接在RC-160的主鏈末端。與未修飾的RC-160相比較,修飾后的RC-160對(duì)于胰島素有更高的抵抗能力和更長(zhǎng)的半衰期。2固相多肽的制備多肽側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾是通過(guò)選擇性試劑(也稱(chēng)修飾劑)與多肽側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn),從而改變多肽的化學(xué)性質(zhì),如消除免疫原性和免疫反應(yīng)性、延長(zhǎng)了多肽藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間等。DavidSabatino等在對(duì)生長(zhǎng)激素釋放多肽(growthhormonereleasingpeptide,GHRP-6)類(lèi)似物的合成研究中,通過(guò)對(duì)Trp2、Ala3、Trp4的化學(xué)修飾,在側(cè)鏈上連接不同的基團(tuán)(如圖1所示),從而形成氮雜多肽(aza-peptide)。在考察經(jīng)修飾的各種氮雜多肽的IC50時(shí),發(fā)現(xiàn)其中一種結(jié)構(gòu)為His-D-Trp-Ala-azaPhe-D-Phe-Lys-NH2的氮雜多肽與受體的結(jié)合率是未經(jīng)修飾的GHRP-6的1000倍。正交保護(hù)氨基酸在固相多肽合成中的應(yīng)用對(duì)多肽的側(cè)鏈修飾起著重要的作用。正交保護(hù)是指在一定條件下,分子中的一組保護(hù)基可以被選擇性地脫除,而其他保護(hù)基不受影響,進(jìn)而達(dá)到可選擇性修飾的目的。謝東等在合成的長(zhǎng)效HIV融合抑制劑艾博衛(wèi)泰中,對(duì)第13位的賴(lài)氨酸(Lys)采用Alloc保護(hù)的Fmoc-Lys(Alloc)-OH,用特定的條件選擇性地脫除保護(hù)基Alloc,而另一氨基保護(hù)基Fmoc和肽鏈上其他氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基均不受影響,再用Fmoc-AEEA(Fmoc-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)和MIPA(3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸)對(duì)Lys13進(jìn)行修飾,使肽鏈進(jìn)入血液后能夠迅速與白蛋白結(jié)合,從而發(fā)揮長(zhǎng)效的作用。經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,艾博衛(wèi)泰的半衰期可長(zhǎng)達(dá)2周。對(duì)肽鏈中某一個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾是側(cè)鏈修飾的一項(xiàng)前沿的、重要的技術(shù),也是實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈修飾可控的保證。PengWu等報(bào)道了重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),通過(guò)基因編碼乙醛標(biāo)記可對(duì)重組蛋白中的某些特定位點(diǎn)進(jìn)行特異性的乙醛標(biāo)記,這些乙醛標(biāo)記既可作為定點(diǎn)修飾的位點(diǎn),也可用于進(jìn)一步的化學(xué)修飾。這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用在對(duì)單克隆抗體、多肽類(lèi)藥物等的定點(diǎn)修飾中。3調(diào)節(jié)因子t對(duì)多肽形成的影響在多數(shù)情況下,機(jī)體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見(jiàn)的直鏈肽的兩端進(jìn)行逐步的切割分解,使直鏈肽被降解,因此,對(duì)肽鏈進(jìn)行環(huán)化結(jié)構(gòu)改造,可以提高多肽類(lèi)藥物在機(jī)體內(nèi)的生物穩(wěn)定性,延長(zhǎng)半衰期。按照橋頭環(huán)化位置可將環(huán)肽分為5類(lèi):C端與N端相連、側(cè)鏈間相連、N端與側(cè)鏈相連、C端與側(cè)鏈相連以及主鏈上的N-N相連,如圖2所示。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(growthregulatingfactor,GRF)是由29個(gè)氨基酸組成的多肽,肽序?yàn)閅ADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR。該多肽在37℃的豬血漿中的半衰期只有15min。研究人員選取不同位點(diǎn)進(jìn)行環(huán)化處理,得到不同的衍生物,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,其半衰期明顯提高到4h以上。AnnettRozek等報(bào)道了一吲哚類(lèi)多肽類(lèi)似物CP-11,結(jié)構(gòu)為ILKKWPWWPWRRK-NH2,通過(guò)二硫鍵進(jìn)行成環(huán)修飾,得到cycloCP-11,在胰島素共同存在和作用下,可以使胰島素的半衰期由4min提高到18min。LEDGF(lensepithelium-derivedgrowthfactor)/p75是HIV-1整合酶。Zvi等通過(guò)對(duì)LEDGF/p75結(jié)構(gòu)和功能的研究,取該蛋白質(zhì)中的一段肽鏈,合成HIV-1整合酶抑制劑LEDPG361-370,合成過(guò)程中應(yīng)用Alloc保護(hù)的氨基酸,并進(jìn)行特異性保護(hù)基的脫除,實(shí)現(xiàn)直鏈肽的首尾成環(huán)(圖3)。LEDPG361-370半衰期可長(zhǎng)達(dá)8d。4西曲瑞克氨基酸lhs替換肽鏈中的某幾個(gè)氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長(zhǎng)的方式,替換對(duì)象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。將L型氨基酸替換為D型非天然氨基酸是氨基酸替換的一種常規(guī)方法。西曲瑞克(cetrorelix)是一種促黃體激素釋放激素(luteinizinghormonereleasinghormone,LHRH)拮抗劑,用于治療子宮纖維瘤、子宮內(nèi)膜異位、卵巢癌以及改善良性前列腺肥大。西曲瑞克是將LHRH中的幾個(gè)氨基酸替換為非天然的D型氨基酸,結(jié)構(gòu)對(duì)比如圖4所示。西曲瑞克在多種酶存在的情況下半衰期可長(zhǎng)達(dá)50h,而LHRH的半衰期只有幾小時(shí)。從西曲瑞克的用法和劑量也可以看出其長(zhǎng)效性:單劑量給藥0.25mg,作用可持續(xù)24h;一次注射3mg,藥效可維持4d。Strausberg等對(duì)枯草桿菌蛋白酶中隨機(jī)的一段12個(gè)氨基酸組成的多肽鏈進(jìn)行氨基酸替換,以對(duì)溫度的穩(wěn)定性和催化活性為基礎(chǔ)進(jìn)行篩選。篩選結(jié)果表明,在高溫環(huán)境下,修飾后的產(chǎn)物半衰期最大可高達(dá)原枯草桿菌蛋白酶的15000倍。粒細(xì)胞多肽(humanneutrophilpeptides,HNP)是一種具有抗微生物活性和細(xì)胞毒性的多肽,其對(duì)胃癌細(xì)胞具有一定的毒性作用。Linda等將人類(lèi)嗜中性粒細(xì)胞肽(humanneutrophilpeptides,HNPs)序列中的精氨酸(Arginine)替換為鳥(niǎo)氨酸(Ornithine),通過(guò)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)168h后仍有26%的經(jīng)修飾后的HNP-Ornithine存在。5阿片受體抗劑糖肽是指寡糖結(jié)構(gòu)與多肽鏈中某些特殊氨基酸側(cè)鏈上的功能團(tuán)以共價(jià)鍵的形式相連接的一類(lèi)多肽類(lèi)物質(zhì)。糖基化修飾是指多肽附加上糖類(lèi)的這一過(guò)程。在多肽的固相合成中,最常用的為N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化通過(guò)天冬酰胺使側(cè)鏈的酰胺氮進(jìn)行連接。O-糖基化是指多肽與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的氧相連接。多肽藥物的糖基化修飾增加了側(cè)鏈的空間位阻,提高了多肽對(duì)酶的穩(wěn)定性。如alglucosidasealfa(myozyme,shire)用于治療龐培氏病,按20mg/kg(體質(zhì)量)劑量,每2周注射1次。darbepoetinalfa(aranesp,amgen)是促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(erythropoietin,EPO)糖基化修飾后的產(chǎn)品,用于治療慢性腎功能衰竭及貧血,使用頻率從老一代EPO的每周2~3次降低至每周1次或每2周1次。TY027是一種阿片受體拮抗劑,在大鼠血漿中的半衰期只有4.8h。為了得到更加穩(wěn)定的止痛劑,Takashi等以TY027為原型進(jìn)行糖基化修飾,引入一個(gè)O-β-(Ser(Glc)),以Fmoc-Ser(O-β-D-Glc(OAc)4)-OH為原料,通過(guò)Fmoc固相合成多肽法得到TY027糖基化的修飾產(chǎn)物,TY027及該修飾后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖5所示。通過(guò)代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),在大鼠血漿中孵化24h仍然有70%完整的該修飾產(chǎn)物能被檢測(cè)到。G.E.Umpierrez等報(bào)道了LY2189265是一種新型的長(zhǎng)效胰高血糖素(GLP-1)受體拮抗劑,用于治療Ⅱ型糖尿病。通過(guò)糖基化修飾,該藥物只需每周注射1次,大大提高了病人的依從性。6peg修飾多肽類(lèi)藥物聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物,結(jié)構(gòu)式為HO-C(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。PEG類(lèi)修飾劑具有無(wú)毒、良好的溶解性和生物相容性、寬泛的相對(duì)分子量選擇范圍等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)PEG修飾后的多肽類(lèi)藥物相對(duì)分子量有所增加,可降低腎小球的濾過(guò)效率,增強(qiáng)藥物對(duì)酶的穩(wěn)定性,從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期。目前應(yīng)用最普遍的PEG修飾劑是單甲氧基聚乙二醇(mPEG),結(jié)構(gòu)為CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。PEG修飾多肽類(lèi)藥物時(shí),為了使PEG能在較溫和的反應(yīng)條件下與多肽偶聯(lián),故需先將PEG活化,再將活化后的PEG與多肽肽鏈的C端、N端以及側(cè)鏈上的氨基、巰基和羧基進(jìn)行偶聯(lián)。1990年,美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了第1個(gè)PEG修飾蛋白質(zhì)類(lèi)藥物pegademase(adagen,enzon)上市。pegademase是由聚乙二醇修飾的腺苷脫氨酶,用于治療嚴(yán)重的合并性免疫缺陷病癥,給藥頻率為每周1次,從給藥頻率上體現(xiàn)了修飾后藥物的長(zhǎng)效性,減少了病人因頻繁給藥而帶來(lái)的痛苦。到目前為止,已有多種經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物獲FDA批準(zhǔn)上市銷(xiāo)售,包括PEG修飾的天冬酰胺酶、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、干擾素等(表2)。這些藥物在臨床應(yīng)用中也體現(xiàn)出了PEG修飾的優(yōu)勢(shì)。從給藥頻率不難看出PEG修飾在延長(zhǎng)蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物的半衰期上有顯著作用。目前還有大批的研究者致力于PEG修飾多肽類(lèi)藥物的研究,也有很多新的PEG修飾藥物處于研發(fā)甚至臨床階段。但PEG修飾劑本身的分散性造成了修飾后的藥物具有一定分散性,這會(huì)直接影響到產(chǎn)品的生物相容性、化學(xué)性能以及臨床功效等,這也是目前困擾PEG修飾的一大難點(diǎn)。解決途徑:①注重PEG的合成和純化,以保證PEG修飾劑本身的質(zhì)量;②特異性定點(diǎn)修飾技術(shù)的應(yīng)用以及對(duì)最佳反應(yīng)條件的探索。7對(duì)于多肽藥物的長(zhǎng)效化研究據(jù)2010年調(diào)查,目前全世界市場(chǎng)銷(xiāo)售的多肽類(lèi)藥物主要有51個(gè)品種,其中有6個(gè)品種在2008年銷(xiāo)售額超過(guò)了7.5億美元,總銷(xiāo)售額高達(dá)88.3億美元。但由于多肽在體內(nèi)具有不穩(wěn)定性、易被水解、易被腎臟清除等特性,使得多肽類(lèi)藥物半衰期短,從而必須頻繁給藥,因此對(duì)多肽藥物的長(zhǎng)效化研究顯得尤為迫切?；瘜W(xué)修飾是多肽類(lèi)藥物長(zhǎng)效化技術(shù)中的