雙向電泳技術(shù)課件

*1809年俄國(guó)物理學(xué)家Peйce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

*1909年Michaelis首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。

他用不同pH的溶液在U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。

*1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

*1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。

*從上世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。

*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開(kāi)創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。

*由80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。

*雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白。

1*1809年俄國(guó)物理學(xué)家Peйce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

*19一、電泳的基本原理1、在電場(chǎng)作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)。由F=Eq，f=6πrυ

η可得υ=Eq/(6πrη)2、帶電顆粒的泳動(dòng)速度同電場(chǎng)強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷量成正比，與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動(dòng)速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。第一節(jié)蛋白質(zhì)電泳的基本原理2一、電泳的基本原理第一節(jié)蛋白質(zhì)電泳的基本原理2在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。3在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷二、影響電泳速度的因素

1、電場(chǎng)強(qiáng)度；2、緩沖溶液的pH；3、緩沖溶液的離子強(qiáng)度；4、電滲；5、焦耳熱三、電泳的分類

按原理分類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。穩(wěn)態(tài)電泳（或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時(shí)間而變化。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。4二、影響電泳速度的因素455

按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。66③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。7③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層

另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。按pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù)pH電泳，不連續(xù)pH電泳。8另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等。9四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryl1、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：①幾乎無(wú)電滲作用。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無(wú)色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。?凝膠孔徑可調(diào)。?分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。10102、聚丙烯酰胺凝膠的聚合112、聚丙烯酰胺凝膠的聚合11催化劑和加速劑的種類①AP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)cr單體，形成單體長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑Bis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。②核黃素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因?yàn)楹它S素在TEMED及光照條件下，還原成無(wú)色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。12121313丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)：?高濃度酸和堿會(huì)促進(jìn)其水解形成丙烯酸和NH3。?與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成β-芳氧基或烷氧基丙酰胺。?在20℃能NH3反應(yīng)，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。?與一些硫醇反應(yīng)，生成β-烷基丙酰胺。?也會(huì)由于超聲、γ-射線和自然光線引起聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會(huì)受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。14丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)：14凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)?每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%表示；T%=(a+b)/m?a：丙烯酰胺克數(shù)；b：N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積(毫升)。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：15凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：151616濃縮效應(yīng)17濃縮效應(yīng)17聚丙烯酰胺凝膠電泳的異?，F(xiàn)象及解決辦法1.凝膠未聚合2.未加水層時(shí)凝膠聚合3.電泳后未能檢測(cè)出樣品4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.只顯一條區(qū)帶6.分離區(qū)帶呈條紋狀18聚丙烯酰胺凝膠電泳的異?，F(xiàn)象及解決辦法18第二節(jié)蛋白質(zhì)等電聚焦電泳1966年，瑞典科學(xué)家Rible和Vesterberg建立。等電聚焦：isoelectricfocusing,IEF。1.電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。蛋白進(jìn)入時(shí)，不同的蛋白移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白得以分離。2.優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測(cè)定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。3.缺點(diǎn)：需無(wú)鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。19第二節(jié)蛋白質(zhì)等電聚焦電泳1966年，瑞典科學(xué)家Ri

利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非線性）pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析對(duì)象只限于蛋白質(zhì)和其他兩性分子。根據(jù)建立pH梯度原理不同，可分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度（carrierampholytepHgradient)和固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)。20利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一、基本原理1、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：取決于其氨基酸的組成。

組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍很寬，這使得可以利用它來(lái)分離和分析蛋白質(zhì)。

21一、基本原理1、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：取決于其氨基酸的組成。212、聚焦效應(yīng)3、等電聚焦的分辨率222、聚焦效應(yīng)3、等電聚焦的分辨率22二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳1、載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的條件在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品的緩沖能力而改變pH梯度。在等電點(diǎn)處有足夠高的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過(guò)，具備不同pH的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，是整個(gè)體系中的電導(dǎo)均勻。分子質(zhì)量小，便于與被分離的高分子物質(zhì)分離?；瘜W(xué)組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測(cè)定。應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。

由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備(有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體)23二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳1、載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具2、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下自然形成pH梯度，常用該方法。天然pH梯度。242、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：243、載體兩性電解質(zhì)分離原理等電聚焦樣品可放于任何位置。4、載體兩性電解質(zhì)的缺點(diǎn)載體兩性電解質(zhì)合成過(guò)程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置，從而影響了重復(fù)性；負(fù)極漂移現(xiàn)象，使pH梯度不穩(wěn)定；負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無(wú)法聚焦；凝膠灌制重復(fù)性差，凝膠機(jī)械穩(wěn)定性差，影響重復(fù)性。5、等電聚焦中應(yīng)注意的事項(xiàng)pH梯度的選擇；添加中性載體兩性電解質(zhì)；電流降到最小切恒定時(shí)盡快結(jié)束IEF;pH梯度測(cè)定：電泳結(jié)束后，用微電機(jī)檢測(cè)凝膠表面pH;蛋白質(zhì)在pI處形成沉淀。添加表面活性劑。253、載體兩性電解質(zhì)分離原理等電聚焦樣品可放于任何位置。25三、固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù)

固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來(lái)的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。26三、固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù)

固相pH梯度等電聚焦1、固相pH梯度的介質(zhì)其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合行為。271、固相pH梯度的介質(zhì)其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱2、固相pH梯度的建立

固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要?dú)w功于Immobilines試劑（AmershamPharmaciaBiotech,APB）的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個(gè)分子都有一個(gè)單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為：

其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過(guò)程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。所以它是固相的，即使是在電場(chǎng)中也不會(huì)漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH3～10范圍的緩沖體系。所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場(chǎng)條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場(chǎng)中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。282、固相pH梯度的建立固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)

29固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)294、固相pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)3、固相pH梯度等電聚焦原理蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達(dá)到自己的等電點(diǎn)，停止遷移。固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極高，可達(dá)0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾??；對(duì)堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無(wú)邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時(shí)候需要高電壓，電泳時(shí)間長(zhǎng)，窄范圍pH測(cè)定困難，只能計(jì)算。注意事項(xiàng)：溫度：20-30℃；電壓：梯度上升。304、固相pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)3、固相pH梯度等電聚焦原理加樣方式

31加樣方式31等電聚焦電泳進(jìn)行過(guò)程中等電聚焦電泳結(jié)束后（－）（－）高pH高pH低pH低pH32等電聚焦電泳進(jìn)行過(guò)程中等電聚焦電泳結(jié)束后（－）（－）高pH高第三節(jié)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理:天然狀態(tài)生物大分子聚丙烯酰胺凝膠電泳（nativePAGE）,在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中分離蛋白質(zhì)?？傻玫教烊坏鞍踪|(zhì)的分子量。33第三節(jié)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳連續(xù)電泳不連續(xù)電泳濃縮效應(yīng)凝膠層緩沖液離子成分pH電位梯度濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)34連續(xù)電泳濃縮效應(yīng)凝膠層濃縮效應(yīng)342、影響凝膠聚合的因素形成凝膠試劑的純度凝膠濃度溫度和氧氣的影響：23-25℃3、聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)352、影響凝膠聚合的因素35二、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無(wú)關(guān)。加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白的二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到P分子上，形成蛋白-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于蛋白分子量。分離測(cè)定：測(cè)分子量(與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較)鑒定樣品純度(條帶數(shù)目)測(cè)定樣品蛋白含量：掃描定量(比色)

36二、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理362、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響因素溶液中SDS單體的濃度二硫鍵是否完全還原緩沖系統(tǒng)的選擇凝膠濃度的選擇372、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類37凝膠電泳的操作要點(diǎn)1.凝膠制備2.電極緩沖液3.樣品處理及加樣4.電泳5.染色與固定6.脫色7.分析3838？pH值不對(duì)=39？=39第四節(jié)雙向電泳一、基本原理

IEF-SDS40第四節(jié)雙向電泳一、基本原理40非變性2D：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)行。適于分析非共價(jià)鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向SDS-PAG電泳。此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D：樣品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃變性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40條件下進(jìn)行，之后膠條用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后進(jìn)行SDS。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式雙向電泳的分類41非變性2D：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋二、流程（一）樣品制備（二）第一向：等電聚焦1、加樣2、運(yùn)行（三）膠條的平衡（四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（五）膠上蛋白的檢測(cè)1、考馬斯亮藍(lán)染色2、銀染3、負(fù)染4、熒光染色42二、流程42（六）雙向電泳凝膠的檢測(cè)

1、目測(cè)2、自動(dòng)化檢測(cè)3、雙向電泳的數(shù)據(jù)庫(kù)（七）雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)：1、低拷貝蛋白的檢測(cè)受限；2、極酸或極堿蛋白的分離較難；3、分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難；4、難溶蛋白的檢測(cè)較困難；5、得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)43（六）雙向電泳凝膠的檢測(cè)43一維固相pH梯度等電聚焦（IEFwithIPG）：

IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過(guò)乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過(guò)這種方式生成的IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。44一維固相pH梯度等電聚焦（IEFwithIPG）：IPIPG膠條的重泡脹泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來(lái)的IEF。不同的加樣方法和加樣量會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的差異：ProteanIEFcell、IPGphor等集成設(shè)備的使用：20mmol/LDTT墊片的使用：溫度的選擇：45IPG膠條的重泡脹泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)蛋白載樣量影響IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無(wú)需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：46蛋白載樣量影響IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括：46IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量47IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量47IPGIEF中pH梯度的選擇

常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。48IPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性預(yù)分步收集細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜核糖體及其他特定細(xì)胞成份細(xì)胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)3倍3倍亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖49預(yù)分步收集細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜核糖體及其他特定細(xì)胞成份細(xì)胞分泌聚焦時(shí)間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過(guò)度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過(guò)多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。50聚焦時(shí)間的優(yōu)化理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最I(lǐng)EF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid51IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3t兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS時(shí)電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。52兩維間的平衡一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無(wú)需濃縮膠，因?yàn)樵贗PG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。53二維SDS同普通SDS類似。53聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè)理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡(jiǎn)單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：54聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè)理想顯色劑的7S54有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無(wú)背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。55有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。56負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。57膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過(guò)SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。58有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)