冰凍切片漂片

免疫熒光操作步驟（漂片，冰凍切片）免疫組化步驟：將腦片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗說明書，加3%雙氧水封閉10min（如果是從切片保護液取出，則要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差別），本實驗室使用的二抗試劑盒為中杉金橋超敏二步法試劑盒；吸去雙氧水，PBS洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；然后，4C,過夜（18h或者24h），不建議使用37C；然后，PBS洗凈兩遍；剩下步驟見二抗試劑盒說明書。DAB配方為：lOmgDAB固體加到20ml0.01MPBS，臨用時加100-200微升30%雙氧水，注意避光。顯色10min，看片子染色深淺情況適當調(diào)整顯色時間。一般 3分鐘顯色就比較明顯，如果20分鐘仍未顯色，則看下面的參考。然后PBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片，自然晾干。干燥天氣 2-3h，潮濕天氣3-4h。脫水：70%酒精3min,95%酒精3min,100%酒精3min,100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上鹽分較多，在70%酒精前在雙蒸水1min。免疫熒光步驟及注意事項：將腦片放到6空板的山羊血清封閉液中，封閉 20-40min;（如果是從切片保護液取出，則要用 PBS洗一遍）吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入 PBS稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上,要重新加或者加大量,使腦片完全浸入液體；4C,過夜（18h或者24h），不建議使用37C，如果熒光亮度不強，可以延長孵育時間到 48或72小時；然后，PBS洗凈兩一一三遍，按照二抗說明書稀釋的熒光二抗，室溫孵育 2小時。注意避光操作。0.01MPBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光自然晾干；滴加防淬滅劑后,蓋上蓋玻片鏡下觀察。常見問題：熒光太暗：可能蛋白表達少；可能一抗孵育時間短；二抗孵育時間短；清洗次數(shù)過多；溶液 pH不合適；熒光萃滅；一抗?jié)舛冗^低或過高；二抗?jié)舛冗^低或過高；激發(fā)波長不在抗體適用波段。背景熒光太深：一抗?jié)舛冗^高,清洗不徹底；二抗?jié)舛冗^高,清洗不徹底；封閉時間過短,非特異性過強；一抗非特異性過強；二抗非特異性過強；顯微鏡熒光強度過強。總之實驗是喜歡強陽性,不喜歡假陰性,呵呵。任何實驗都需要花時間摸索才能找到其最佳的工作條件。另附免疫組化常見問題解析。原理是相同的,只是最后的顯色方法不一樣,有些問題有啟發(fā)作用。免疫組織化學邊緣效應?原因:1）組織邊緣與玻片粘貼不牢,邊緣組織松脫漂浮在液體中,每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致 .解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于 4微米，組織的前期處理應規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織,邊緣的試劑容易首先變干,濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織,應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時,為了避免油劑的影響,畫圈應距組織邊緣3-4mm。產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。解決辦法:這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織）,需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；DAB孵育時間過長或濃度過高；PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗或 SP孵育之后的浸洗尤為重要；標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強非特異性著色。免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產(chǎn)的工作液，怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果？另外不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合 ;建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復。3、組織切片本身這種抗原含量低；4、血清封閉時間過長。5、 DAB孵育時間過短。6、 細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應。7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。背景強的原因？1,考慮一抗?jié)舛雀撸?,然后調(diào)整DAB孵育時間；3,也要考慮血清封閉時間是否過短適當增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。DAB顯色真的需要3-10分鐘嗎？我之前做的顯色40秒就夠了，再多本底就太深，現(xiàn)在做另一個顯色3分鐘也不出，真的有必要延長顯色時間嗎？DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？，1烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度二，用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做三，有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖 PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織，四，用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。年前爬的細胞片在-20度放了半年（保鮮膜密封），現(xiàn)在取出來再作，做了兩次，步驟均是按以前的作的，但今天做時，原來顯色很強的片子現(xiàn)在顯色很弱了，問什么呢？是不是片子放的時間太長了？抗體在 4度放的時間也不長而且這次濃度比以前做的還高?首先，抗體濃度和孵育時間在免疫組化中至關重要。在抗原抗體反應并非抗體濃度越高，反應越強烈，這叫前帶現(xiàn)象。所以選擇最佳的一抗?jié)舛群头跤龡l件也是十分重要的，其實抗體濃度過高或過低均會引起陰性。我到認為你這片子的影響可能更大。盡管在 -20度保存，但是時間一般超過3個月就不能保證其中抗原的丟失，建議可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。你說抗體放在4度保存是指未稀釋還是稀釋后抗體，存放多長時間？一般稀釋后抗體不能保存很長時間的。為什么切片傾斜，抗體分布不均勻，就會造成一半陽性，一半陰性？我認為，即使切片傾斜，抗體覆蓋少的那部分組織和其他部分抗體的濃度是一樣的，只是抗體體積的大小差異！如果說抗體傾斜沒覆蓋好的地方是陰性，那為什么不是干片所導致的非特異性高背景的染色呢？當切片傾斜到有一半甚至都沒液體時， 就會出現(xiàn)陰陽臉樣的著色。你認為呢？9?高溫抗原修復后就沒必要滅火內(nèi)源性過氧化物酶 ？經(jīng)過高溫POD已經(jīng)滅活了，不錯POD是被被滅活了，但它仍有還原能力，仍能跟DAB發(fā)生氧化還原反應，使DAB顯色，我們用雙氧水是耗竭POD的還原能力，使之不能在跟DAB反應。所以無論修復與否都應該滅活 POD，盡可能消除非特異性著色。冰凍切片有時會有小洞?冰凍切片有時會發(fā)現(xiàn)切片上會有空洞，這是因為組織在冰凍過程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是組織冰凍時間太慢，或者冰凍的溫度不夠低，慢慢形成冰晶，二是有些組織在冰凍之前需要做適當?shù)墓潭?，如腦組織，然后放入30%的蔗糖4度冰箱過夜以減少冰晶形成，并且能最大程度保持組織細胞形態(tài)。另外在切片是組織塊復溫要在37度速融，否則易造成組織塊的破壞。常用免疫組化結(jié)果分析方法?陽性著色細胞計數(shù)法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組 3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可?；颐芏确治龇?。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 imagej進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（ 0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分數(shù)相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。DAB呈色后到底什么樣染色是特異性染色？陽性標記可以從色度特征，陽性標記細胞學特征來進行基本的判斷。色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，標記方法越敏感，陽性結(jié)果顯色則越強。根據(jù)陽性標記的顯色程度分為：淡黃色，提示為弱抗原；棕黃色，提示為中等度抗原；棕黑色，示為強抗原。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判斷依據(jù)。細胞學特征：陽性表達必須在細胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的陽性表達即使陽性也不應作為判斷依據(jù)。一般分為胞膜型，胞核型，胞質(zhì)型，微絨毛型,復合型幾種。這是需要結(jié)合背景知識的。同樣，非特異性染色也有一定的特點：它首先是指抗原無明確定位，各種細胞累及一片，色度無深淺之分，這種標記組織片不能作為免疫組織標記結(jié)果判斷的依據(jù)，造成非選民性染色的原因常為組織標本固定不佳，抗體質(zhì)量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，一般情況下，陽性細胞與陰性細胞相互交雜，陽性染色強度深淺不一。如果缺乏細胞音的不均一性染色，即或呈陽性染色，常提示為非特異性染色。另外，組織片邊緣反應和出血壞死灶周圍陽笥反應不能作為診斷依據(jù)。13.1.石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？我用組織芯片和普通切片在多種條件下進行了抗原修復實驗， 發(fā)現(xiàn)在熱修復后，組織脫片最主要原因是組織脫水不良，腫瘤組織黏附性差在小塊組織時也容易撕脫（減小熱修復加熱功率，PBS沖中洗時不要直對組織沖洗、可以有效防范）。DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？這就是免疫組化染色的陰陽臉，免疫組化實驗是環(huán)環(huán)相扣的實驗，任何一步試劑孵育不全（沒有均勻的在組織上孵育）都可能導致這樣的結(jié)果。免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？那就要考慮真陰性還是假陰性！假陰性是你操作不當或者試劑質(zhì)量的問題了。切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？你的抗體是否特異，孵育時間溫度濃度是否過長！一抗從4度拿出后，為什么有人說要37度復溫，目的是什么？我沒遇到這樣的說法，是否是想加速復溫？還有我不知道國內(nèi)的院校為什么對37C孵育如此感興趣，在你們買國外抗體時，他們的說明書上除了酶修復要37C外，其他步驟中均沒有說要在37C中孵育。免疫組化中抗原修復的最佳條件是什么？尤其微波修復?？乖迯蜎]有什么最佳條件只有可能管用的修復條件。有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細胞，對石蠟切片需要否？tritonX100是脂質(zhì)溶解劑，做免疫細胞化學時細胞膜是完整的半透膜，孵育的抗體要自由的通過細胞膜就要用tritonX100來破膜。石蠟切片細胞多數(shù)是切開狀態(tài)了。但是脂質(zhì)有時會吸附抗體，含脂質(zhì)高的組織也可以用triton。蘇木素復染的時間應該是多少？復染過度咋辦？要看你是用什么蘇木素，免疫組化復染，不比我們平常的 HE,它只要一般的輕微染色就