山東大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)方法

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞生物學(xué)的研究方法歸納起來大體上可劃分為四大類：形態(tài)觀察、生化分析、生理檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)性操作技術(shù)。光學(xué)顯微鏡（lightmicroscope）電子顯微鏡（electronmicroscope）掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope）第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法尼康E-600顯微鏡

一、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡普通顯微鏡由聚光器、物鏡和目鏡三部分組成。小鼠肝細(xì)胞中糖原人肝癌細(xì)胞中的微絲蛋白LightPathwayofMicroscope普通顯微鏡最大放大倍數(shù)1000－1500倍因?yàn)樗姆直媛视邢?，再放大也是空放?/p>

分辨率（resolution）：能將物體相近兩點(diǎn)分辨清楚的距離極限

D代表分辨力：D=0.61

/N.A.

代表光波波長(zhǎng)；N.A.為鏡口率，也稱數(shù)值孔徑（Numericalaperture)。

N.A.=n

Sin

/2

n：物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率；（1或1.515）

：鏡口角（聚光焦點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角，<180o）物鏡鏡口

標(biāo)本結(jié)論：通過公式可知光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.2um減小分辨率需減小

介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（1.7）越好。sinα/2的最大值小于1；普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，光鏡分辨力約為0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。（二）紫外線顯微鏡（ultravioletmicroscope）根據(jù)光學(xué)原理，光源光波越短，顯微鏡的分辨本領(lǐng)越大。紫外線顯微鏡以紫外線為光源，分辨率可提高一倍?？煽吹皆谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡下看不到的膠體顆粒。可用來測(cè)定細(xì)胞中的核酸含量。透鏡：石英、螢石（CaF2)、碳酸鋰等制作。價(jià)格昂貴，使用受限。（三）熒光顯微鏡（fluorescentmicroscope）20世紀(jì)40年代在紫外線顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)明。原理：細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射也可發(fā)熒光。熒光顯微鏡對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究。結(jié)構(gòu)：在普通光學(xué)顯微鏡上添加一些附件：A.光源：通常采用超高壓汞燈或氙燈，由它發(fā)出各種波長(zhǎng)的光。B.濾片：根據(jù)性能分為兩組。一組是激發(fā)濾片，作用是僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其它光都吸收掉。二是阻斷濾片，安裝在物鏡后，作用是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡，以免干擾熒光和刺傷眼睛；選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡熒光顯微照片(微管綠,微絲紅,核藍(lán))（四）暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）原理：顯微鏡加裝特殊裝置，使直射光不能進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射、衍射的光線進(jìn)入物鏡特點(diǎn)：視野的背景是暗的，樣品是的邊緣是亮的。特殊裝置：在聚光器中加裝中央遮光板或者使用暗視野光闌暗視野照明方式

能見到小至5nm的質(zhì)點(diǎn)，分辨率比普通顯微鏡高40倍。有些細(xì)胞器如核、線粒體亦可見。能夠看到正在運(yùn)動(dòng)的微小物體（如精子），也能看到不運(yùn)動(dòng)的及某些不能被染色的脂粒，因而常用于微生物與膠體化學(xué)研究。（五）相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）相差顯微鏡由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。原理：將透過標(biāo)本的可見光的光程差（也就是相位差）變成光強(qiáng)差（即振幅差），從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。

相差顯微鏡體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞構(gòu)造：聚光器或光源上安裝環(huán)狀光闌（annulardiaphragm)；在物鏡中加了環(huán)形相板(annularphaseplate)。光闌的作用：使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。光線透過標(biāo)本發(fā)生衍射，偏離了未透過標(biāo)本的光線線路，波長(zhǎng)延遲1/4

。相板作用：相板上有一環(huán)形區(qū)制成凹槽或凸起，器深度可使通過此區(qū)的光線提前或延遲1/4

。主要用于觀察活細(xì)胞或活組織，是體外細(xì)胞和組織培養(yǎng)工作的重要工具。（六）微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrast(DIC)microscope

）1952年，Normaski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明。能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。

DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

分離的有絲分裂紡錘體左、微分干涉顯微鏡；中、相差顯微鏡；右、偏振光顯微鏡。（七）激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）

用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量。

laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)光學(xué)顯微鏡小結(jié)普通光學(xué)顯微鏡：0.2um紫外線顯微鏡：0.1um熒光顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡微分干涉差顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡二、電子顯微鏡（electronmicroscope）簡(jiǎn)稱電鏡電子顯微鏡以電子束代替了可見光，大大提高了顯微鏡的分辨率，可以觀察細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。電子束的波長(zhǎng)與電壓成反比，波長(zhǎng)極短。例如，電壓為6萬(wàn)伏，則

=0.0488埃，比最短的可見光4000埃約小10萬(wàn)倍。德國(guó)西門子公司制成了第一臺(tái)電子顯微鏡，當(dāng)時(shí)分辨率只有3nm。1964年后達(dá)到0.3nm，現(xiàn)在最佳性能的電鏡分辨本領(lǐng)可達(dá)0.1-0.2nm。電鏡的基本構(gòu)造主要如下：

A：電子束照明系統(tǒng)；

B：電磁透鏡成像系統(tǒng)；

C：真空系統(tǒng)；

D：記錄系統(tǒng)；

E：電源系統(tǒng)。

電鏡與光鏡的主要區(qū)別：

光鏡電鏡

光源

可見光電子束

介質(zhì)空氣（香柏油）真空

聚光鏡光學(xué)透鏡電磁透鏡

分辨力

0.3

0.1um0.1nm

放大倍數(shù)

1000倍百萬(wàn)倍

（一）透射電子顯微鏡（TEM：transmissionelectronmicroscope）觀察標(biāo)本內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)放大近百萬(wàn)倍超薄切片（500埃）通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差。

JEM-1011透射電子顯微鏡

正在凋亡的乳腺細(xì)胞核被膜破裂，染色質(zhì)凝集細(xì)胞毒T細(xì)胞結(jié)合到靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）上細(xì)胞毒T細(xì)胞殺死了靶細(xì)胞冰凍蝕刻（freeze-etching)，或冰凍斷裂(freeze-fracture)配合透射電鏡觀察而設(shè)計(jì)的一種標(biāo)本制作技術(shù)。研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有用技術(shù)。主要步驟：

A.冰凍標(biāo)本（-1000C干冰或-1960C液氮）

B.冷刀斷開標(biāo)本（冰凍斷裂）

C.升溫，冰升華，斷裂面結(jié)構(gòu)暴露（蝕刻）

D.表面噴一層蒸汽碳和鉑，

E.將組織溶掉，碳和鉑的膜稱復(fù)膜（replica）F.電鏡下觀察復(fù)膜，復(fù)膜構(gòu)造=標(biāo)本構(gòu)造冰凍蝕刻電鏡照片

（二）掃描電子顯微鏡（SEM：scanningelectronmicroscope）觀察標(biāo)本表面形態(tài)結(jié)構(gòu)標(biāo)本特殊處理：固定脫水后，噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。

JEOL掃描電子顯微鏡

人類血細(xì)胞SEM照片

彈性纖維網(wǎng)

左：狗主動(dòng)脈的低倍掃描電鏡圖片；右：同一血管外層的

縱向排列的致密彈性纖維網(wǎng)（高放大倍數(shù)）。

其它成分已用酶和甲酸消化。一個(gè)典型的有絲分裂中期的染色體近末端區(qū)域的掃描電鏡照片一個(gè)有絲分裂染色體的染色單體的透射電鏡照片一個(gè)正在分裂的動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞，掃描電鏡圖片早期小鼠胚胎的掃描電鏡照片A：2細(xì)胞時(shí)期B：4細(xì)胞時(shí)期C：8-16細(xì)胞時(shí)期，桑椹胚D：胚泡期ABCD三、掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope,STM)Binning,Rohrer等1981年發(fā)明，獲1986年諾貝爾獎(jiǎng)。用來顯示晶體表面原子布陣的一種顯微鏡。原理：加上一定電壓的精密探針。鎢絲或白金絲，直徑幾個(gè)埃。電子在樣品與探針之間（距離幾個(gè)埃）轉(zhuǎn)移形成電流。特點(diǎn)：分辨率高，橫向?yàn)?.1-0.2nm，縱向?yàn)?.001nm.三維圖像。三態(tài)物質(zhì)均可觀察。細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)顯微光譜分析技術(shù)放射自顯影術(shù)超離心技術(shù)分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)第二節(jié)生物化學(xué)分析一、細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)染色是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，從而對(duì)某種成分進(jìn)行研究和分析。細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。例：DNA的Feulgen反應(yīng)顯示法1924年，F(xiàn)eulgen和Rossenbeck發(fā)明。原理：鹽酸水解，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，出現(xiàn)醛基，試劑中的無色品紅與醛基反應(yīng)，呈現(xiàn)紫紅色。例：

PAS（高碘酸席夫反應(yīng)）──鑒定多糖類物質(zhì)醛基與Schiff試劑反應(yīng)，生成紅色化合物。二、免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry)是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特異抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子結(jié)合的小分子；抗體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特異的抗原分泌的r球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。

方法：原位分析體外蛋白質(zhì)分析（一）原位分析★免疫反應(yīng)

直接法：Ag+Ab*

鏡檢（*代表標(biāo)記物）間接法：Ag+Ab1+Ab2*

鏡檢標(biāo)記物可以為多種：熒光素─免疫熒光技術(shù)或稱熒光抗體法酶─酶標(biāo)抗體法放射性同位素標(biāo)記—放射自顯影鐵蛋白標(biāo)記免疫膠體金技術(shù)常用標(biāo)記物：熒光素、酶。常用熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明；常用的酶：辣根過氧化物酶。動(dòng)物細(xì)胞的分裂過程（二）體外蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting）技術(shù)路線：（圖）樣品制備—樣品分離—樣品轉(zhuǎn)移—免疫反應(yīng)——檢測(cè)蛋白質(zhì)由SDS聚丙烯凝膠

硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移的過程即為印跡（blotting）三、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線，如核酸的吸收波長(zhǎng)260nm，蛋白質(zhì)280nm。有些成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對(duì)可見光有特定的吸收光譜。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用細(xì)胞分光光度計(jì)對(duì)一定的成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測(cè)定。四、流式細(xì)胞術(shù)*儀器：流式細(xì)胞計(jì)—flowcytometer*特點(diǎn)：細(xì)胞是高速運(yùn)動(dòng)的*主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞。五、放射自顯影（radioautography)放射自顯影技術(shù)：利用放射性物質(zhì)使照相乳膠膜感光，再經(jīng)顯影以顯示該物質(zhì)自身的存在部位的技術(shù)。由于有機(jī)大分子均含有碳、氫原子，實(shí)驗(yàn)室一般采用14C、3H標(biāo)記。14C、3H均為弱β放射性同位素，半衰期長(zhǎng)。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷顯示RNA。在研究蛋白質(zhì)和粘多糖時(shí)，分別選用3H氨基酸、3H甘露糖、3H巖藻糖等。3H-尿嘧啶脈沖標(biāo)記的細(xì)胞，示異染色質(zhì)區(qū)（核內(nèi)白色區(qū)）無轉(zhuǎn)錄活性五、超離心技術(shù)高速離心：10000—25000r/min超速離心：轉(zhuǎn)速大于25000r/min沉降系數(shù)（“S”—Svedbergunit）:單位離心場(chǎng)中溶質(zhì)分子的沉降速度1S相當(dāng)于1

10-13s離心目的：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。離心種類：分析離心：用于分析和測(cè)定制劑中的大分子的種類和性質(zhì)等制備離心：差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離（介質(zhì)蔗糖、氯化銫）微粒體(microsomes)在超離心時(shí)，分離出的小泡狀成分，系由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜的碎片組成，小泡的外表面常附有核糖體，是研究糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能活動(dòng)的良好材料。六、分子雜交技術(shù)（molecularhybridization)原理：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。方法：原位雜交體外分析核酸的主要方法★Southernblotting又稱DNA印跡法Northernblotting又稱RNA印跡法原位雜交（insituhybridization)：在不破壞細(xì)胞或細(xì)胞器的情況下，用核酸探針檢測(cè)特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術(shù)。染色體在高pH值條件下，DNA解鏈，帶標(biāo)記的核酸探針即刻與染色體一定部位雜交。既可檢測(cè)DNA序列，也可檢測(cè)RNA序列。帶放射性的DNA探針，放射自顯影；免疫探針法。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交

熒光原位雜交顯示的著絲粒衛(wèi)星DNA（黃）七、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：將DNA片段經(jīng)過若干次解鏈和復(fù)性循環(huán)，大量擴(kuò)增，甚至可擴(kuò)增到十幾億倍，以便于對(duì)已知DNA片段進(jìn)行分析，如基因分析、序列分析、進(jìn)化關(guān)系分析和臨床診斷等。一般可擴(kuò)增106-107。DNA聚合酶：Taq酶，來源于一種嗜熱水生菌。最適作用溫度75-80度，95度下短時(shí)間不失活。第三節(jié)細(xì)胞生理學(xué)技術(shù)1、膜電位檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)外存在電位差（20~100mV）稱為膜電位，膜電位的變化反應(yīng)了細(xì)胞的生理變化2、膜片鉗位記錄技術(shù)主要用于檢測(cè)單個(gè)特定離子通道性質(zhì)及變化3、細(xì)胞電泳細(xì)胞表面帶有許多電荷，因而可以在外加電場(chǎng)的作用下移動(dòng)第四節(jié)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動(dòng)十分困難。活細(xì)胞離體培養(yǎng)（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)20世紀(jì)初，Harrison（1907）兩棲類胚胎神經(jīng)管組織懸浮培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞存活多天，觀察到神經(jīng)細(xì)胞分化成神經(jīng)元，伸出了軸突。20世紀(jì)40年代，W.Earle和R.Dulbecco設(shè)計(jì)出細(xì)胞培養(yǎng)液配方，并將組織分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工作廣泛展開。體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)：接觸抑制現(xiàn)象細(xì)胞消化方法：酶法：胰酶，果膠酶非酶法：EDTA細(xì)胞培養(yǎng)方式：A.

群體培養(yǎng)（massculture)：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層。B.

克隆培養(yǎng)(clonalculture)：將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生殖生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，此種集落即稱為克?。╟lone)。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

C.

轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：使用大容量的原培養(yǎng)瓶，在培